HPLC法测定三种制剂中水杨酸的含量

白 林，蔡 乐，徐风华，王欢欢（解放军总医院药品保障中心，北京 100853）

水杨酸软膏、水杨酸硫软膏、复方硫软膏收载于《中国人民解放军医疗机构制剂规范》[1]，三种制剂处方中均含有水杨酸，其共同的特点是抗真菌、止痒，常用于皮肤癣症、真菌感染及皮炎湿疹等。以上制剂应用多年，是临床疗效显著的医院制剂，在原质量标准中，复方硫软膏中的水杨酸无含量测定项；水杨酸软膏、水杨酸硫软膏中水杨酸的含量测定方法为酸碱滴定法，由于软膏基质为酸性，对水杨酸含量测定的结果有影响，导致结果易偏高。本实验建立一种HPLC法，用于三种制剂中水杨酸的含量测定，以期为有效控制制剂质量提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪（包括1200系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、VWD检测器和化学工作站，美国Agilent公司）；UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）。

水杨酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号100106-201104）；甲醇为色谱纯、磷酸二氢钠为分析纯。水杨酸软膏（本院自制，规格：20 g，批号20130415、20130416、20130417）；水杨酸硫软膏（本院自制，规格：20 g，批号20130415、20130416、20130417）；复方硫软膏（本院自制，规格：20 g，批号20130420、20130421、20130422）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇- 0.1 mol·L-1磷酸二氢钠（30∶70）；检测波长：231 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

（1）对照品溶液：取水杨酸对照品约0.030 8 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液（含水杨酸308 μg·mL-1）；精密量取上述储备液5 mL，置25 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（水杨酸61.6 μg·mL-1）。

（2）供试品溶液：分别取水杨酸软膏、水杨酸硫软膏、复方硫软膏（含水杨酸均为3%）约0.5 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加无水乙醇约30 mL，置于水浴加热振摇使溶化，放冷至室温，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，冰浴1 h后，精密量取上清液5 mL，置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

（3）阴性对照溶液：按处方比例取除水杨酸以外的其余成分，按三种制剂的制备工艺制成阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.3 系统适用性实验

取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，水杨酸的保留时间约为8 min，分离度大于2.0，理论塔板数以水杨酸峰计算大于5000。详见图1。

2.4 线性关系考察

分别精密量取对照品储备液并以流动相为溶剂稀释，得系列标准溶液，含水杨酸分别为12.32、30.80、61.60、92.40、123.20 μg·mL-1，分别取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积值为纵坐标（Y），进样量（μg·mL-1）为横坐标（X）绘制标准曲线，得回归方程：Y = 27.073 8 X – 3.250 6，r = 1.000 0。实验表明水杨酸在12.32 ~ 123.20 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度实验

精密吸取对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，连续重复进样6次，记录峰面积值，水杨酸RSD为0.48%，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性实验

分别取水杨酸软膏（批号20130415）、水杨酸硫软膏（批号20130415）、复方硫软膏（批号20130420）适量，按供试品溶液制备方法分别制备6份供试品溶液，分别进样10 μL，水杨酸在水杨酸软膏、水杨酸硫软膏、复方硫软膏的含量及RSD（n = 6）分别为99.82%、0.34%；101.64%、0.87%；98.74%、0.41%。表明本方法重复性良好。

图1 水杨酸HPLC色谱图A – 对照品，B – 水杨酸软膏供试品，C – 水杨酸硫软膏供试品，D –复方硫软膏供试品，E – 水杨酸软膏阴性对照，F – 水杨酸硫软膏阴性对照，G – 复方硫软膏阴性对照；1 – 水杨酸Fig 1 HPLC chromatograms of the salicylic acidA – reference substance, B – salicylic acid ointment sample, C –salicylic acid and sulfur ointment sample, D – compound sulfur sublimate ointment sample, E – negative reference for salicylic acid ointment, F – negative reference for salicylic acid and sulfur ointment,G – negative reference for compound sulfur sublimate ointment; 1 –salicylic acid

2.7 稳定性实验

取上述三种制剂，按供试品溶液制备方法配制供试液，分别在0、1、3、6、9 h进样10 μL，水杨酸软膏（批号20130415）、水杨酸硫软膏（批号20130415）、复方硫软膏（批号20130420）中水杨酸的峰面积平均值、RSD分别为1 624.6、0.62%；1 633.8、0.56%；1 651.6、0.39%。

2.8 回收率实验

取水杨酸分别精密称定，按处方比例分别加入其余成分，按三种制剂的制备工艺制成样品，按供试品溶液制备方法制成样品溶液。依照“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图及峰面积，计算回收率。结果见表1 ~ 3。

2.9 样品含量测定

三批水杨酸软膏（批号20130415、20130416、20130417）水杨酸的标示量分别为99.82%、101.38%、100.67%。三批水杨酸硫软膏（批号20130415、20130416、20130417）水杨酸的标示量分别为101.64%、102.67%、98.45%。三批复方硫软膏（批号20130420、20130421、20130422）水杨酸的标示量分别为98.74%、97.58%、101.09%。

表1 水杨酸软膏回收率实验测定结果Tab 1 Recovery test of salicylic acid ointment

表2 水杨酸硫软膏回收率实验测定结果Tab 2 Recovery test of salicylic acid and sulfur ointment

表3 复方硫软膏回收率实验测定结果Tab 3 Recovery test of compound sulfur sublimate ointment

3 讨论

3.1 水杨酸含量测定方法的选择

水杨酸的含量测定方法主要有中和法[2-3]、紫外分光光度法[4-5]等。由于软膏基质为酸性，因此中和法测定软膏中水杨酸对于结果的影响为含量偏高。由于软膏基质中羊毛脂有紫外吸收，用紫外分光光度法直接测定水杨酸的含量，影响结果的准确性。参考文献[6-8]以高效液相色谱法测定复方制剂中的水杨酸，以甲醇-水（40∶60）、甲醇-冰醋酸（45∶55）、甲醇-0.1 mol·L-1磷酸二氢钠（52∶48）、（30∶70）分别作为流动相进行比较，甲醇- 0.1 mol·L-1磷酸二氢钠（30∶70）为流动相，柱温35 ℃[9]，检测波长为231 nm，峰形较好，杂质峰无干扰，灵敏度高。

3.2 样品中水杨酸提取方法的选择

提取软膏中的水杨酸，以甲醇、乙醇分别作为溶剂，水杨酸在乙醇中溶解性好，提取完全，溶剂对人体和环境的污染少。常温时软膏黏度较大，取样后转移至容量瓶中难度较大。经实验发现80 ℃的乙醇可将基质软化，提高基质流动性，样品转移完全。使用乙醇提取后，冰浴1 h使辅料沉淀，滤过后加入流动相稀释，混匀后再用0.22 μm微孔滤膜滤过后进样，以减小供试品对色谱柱的损害。

3.3 取样量的计算

以上三种制剂中水杨酸的含量按3%计算，取样量均为0.5 g。在《中国人民解放军医疗机构制剂规范》[1]中三种制剂有不同的规格，如水杨酸软膏尚有高于和低于此规格的情况，可根据不同的规格进行折算取样量。

结果表明，本方法操作简便，准确性高，重复性好，用同一种方法可解决上述三种制剂中水杨酸的含量测定问题。