百草枯致肺纤维化大鼠肺组织中Smo、Gli1的表达变化及意义

周媛媛，曾凡军

(1三峡大学第一临床医学院，湖北宜昌443000;2宜昌市中心人民医院)

百草枯(PQ)是联吡啶类除草剂，中毒后出现的不可逆的肺间质纤维化是主要致死原因，病死率高达80%，但中毒机制不明。Sonic hedgehog(SHH)信号途径是肺脏结构形成和发育过程中重要的信号转导途径［1］，其在肝、肾等器官纤维化过程中均存在异常活化现象［2］。SHH途径是否参与PQ所致肺纤维化目前尚不清楚。Smo和Gli1是SHH途径的2个重要分子［3～5］，本研究通过检测 PQ致大鼠肺纤维化后Smo和Gli1的表达，探索SHH信号途径在PQ致大鼠肺纤维化中的作用，进一步了解PQ致肺纤维化的中毒机制。

1 材料与方法

1.1 材料 PQ农药购于郑州沙隆达植物保护技术有限公司(农药登记证号:PD20090712)。雄性SD健康大鼠40只，来自三峡大学医学院实验动物中心，SPF 级，体质量(255±25)g。

1.2 分组及模型制备方法 40只雄性SD大鼠随机分为2组:PQ组、生理盐水对照组(NS组)，每组20只。PQ组一次性腹腔注入PQ农药40 mg/kg;NS组一次性腹腔注射生理盐水40 mL/kg。21 d后处死大鼠，开胸取右肺组织。

1.3 大鼠肺组织病理组织学检查 观察两组大鼠肺组织外观后，石蜡切片HE染色，在光学显微镜下观察肺组织病理学改变。

1.4 Smo和Gli1免疫组化检测 采用SP法。免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司，免疫组化检测严格按试剂盒说明书进行操作。组织脱蜡，0.3%H2O2阻断过氧化酶活性;抗原热修复处理后;以稀释的兔抗Smo和Gli1多克隆抗体孵育过夜，阴性对照用PBS代替一抗，二抗采用山羊SABC过氧化物酶试剂盒，再用DBA试剂盒显色。按照肺组织细胞胞膜及胞质或胞核出现的黄色、棕黄或褐色颗粒作为染色强度判断标准，并结合着染细胞和组织分布范围大小，综合整个切片，双盲法由2位病理科医生对每张切片染色结果独立进行评估:无表达(-)、弱表达(±)、低表达(+)、中表达(++)、高表达(+++)。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两变量间的相关性检验采用Spearman等级相关分析法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

NS组大鼠肺脏外观肺组织色泽红润，表面光滑，弹性好。光镜观察未出现明显病理改变。PQ组大鼠肺脏外观肺组织呈苍白色，表面凹凸不平、呈结节样改变及条索状凹沟，体积缩小，硬度增加。光镜观察发现肺组织部分实变，肺泡结构破坏，部分肺泡腔消失，为大量胶原纤维、成纤维细胞增生。见图1。

2.1 Smo和Gli1检测结果 Smo和Gli1蛋白主要分布于支气管上皮、肺泡上皮、血管内皮细胞及部分纤维组织。Smo阳性表达主要定位于细胞膜及胞质，Glil阳性表达主要定位于胞质及胞核。Smo及Gli1在NS组无表达或弱表达，在PQ组表达明显增强，两组比较 P＜0.01。见图2、表1。

图1 两组大鼠肺组织光镜检查结果

图2 Smo和Gli1在两组大鼠肺组织中的表达

表1 两组大鼠肺组织中Smo和Gli1蛋白的免疫组化表达水平(例)

2.2 Smo和Gli1的相关性分析 PQ组Smo及Gli1蛋白的表达呈正相关(r=0.956，P ＜0.001)。

3 讨论

PQ是有机杂环类除草剂，对人畜具有很强的毒性，病死率极高。机体中毒后出现不可逆性肺间质纤维化［6，7］。但其发病机制尚未完全明确，可能与过度氧化反应及基因表达异常有关。目前对PQ所致肺纤维化尚无特异性治疗方法。因此，研究PQ所致肺纤维化机制不仅可以阐明肺纤维化发病的机制，而且对PQ中毒的治疗有重要价值。

SHH途径是动物体内存在的重要信号途径。主要由Hedgehog配体(Shh)、2个膜受体Ptch、Smo及下游的转录因子Gli组成［8］。Smo和Gli1是SHH途径的2个重要分子;Smo蛋白是信息转换器，它能够将细胞外的SHH信号转换成细胞内的Gli1信号，对SHH信号途径具有激活作用。有研究［10］显示，活化的SHH信号与组织纤维化具有密切关系。

本研究发现，腹腔注入PQ的大鼠肺脏呈明显肺纤维化的病理改变，且较注入生理盐水组大鼠肺组织Smo和Gli1蛋白表达明显增强。PQ组Smo及Gli1蛋白的表达呈正相关。由此推断，PQ所致肺纤维化与SHH信号被激活有密切关系，但不清楚激活的SHH信号通过何种机制影响肺纤维化进程。推测可能与 PQ激活 SHH信号途径，SHH蛋白和Patch蛋白结合后，Patch对Smo抑制解除，通过胞质微管上附着的hedgehog信号复合物介导，使转录因子Gli1进入胞核，激活其下游基因表达［11］，导致肺组织纤维化。

可见，SHH信号途径的异常激活可能直接参与了PQ所致肺纤维化的发生、发展过程，而Smo和Gli1蛋白明显表达则可能是SHH信号途径异常激活的机制之一。进一步研究SHH信号途径在PQ致肺纤维化中的作用可能为PQ所致肺纤维化开辟新的治疗途径。

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