三种土荆皮乙酸醇提工艺的比较

张想旺，隋友乐，王春波，战激光，管丽丽，马守江

土荆皮 （Cortex Pseudolaricis）来源于松科植物金钱松（Pseudolarixkaempferi Gord）的根皮和近根树皮，性辛温，有毒，用于治疗手足癣、神经性皮炎、湿疹等［1］。其醇提物与苯甲酸、水杨酸制成的复方土荆皮酊具有良好的止痒、抗真菌的作用，广泛用于手足癣、体癣的治疗。最新研究表明，土荆皮中特征性的二萜酸类成分是其抗真菌、抗肿瘤、抗生育和抗血管生成的主要有效成分，其中土荆皮乙酸（pseudolaric acid B，PAB）含量最高、活性最强［2－5］。目前，土荆皮乙酸通常采用乙醇浸渍法提取，该方法提取效率低下，有效成分提取不完全。文献调研发现国内对土荆皮乙酸的醇提取工艺缺乏系统研究，为此，笔者建立高效液相（HPLC）法测定土荆皮乙酸的含量，设计正交实验优化土荆皮乙酸的醇提工艺，比较三种提取方法对土荆皮乙酸提取率的影响。

1 仪器与试药

LC－10AT 型 HPLC 仪 （日本岛津公司）；AB135－S型，1／100 000电子天平 （瑞士梅特勒－托利多公司）；KQ－500E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器厂）；RE－2000B旋转蒸发器 （上海亚荣生化仪器厂）；摇摆式高速药材调料粉碎机（温岭市百乐粉碎设备厂）。土荆皮乙酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：201003）；土荆皮药材（购自安徽德昌药业饮片有限公司，产地：湖北，批号：120912）；乙腈、乙醇、丙酮、甲醇均为色谱纯，水为超纯水。

2 样品含量测定

2．1 色谱条件 色谱柱：InersilODS－3（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－水－三氟乙酸（500∶500∶1）；流速 1．0 ml／min；柱温25℃；检测波长260 nm；进样量20 μl。此色谱条件下，土荆皮乙酸与提取物中其他成分有较好的分离度。对照品与供试品的保留时间一致（9．87 min），供试品土荆皮乙酸能够较好分离，对照品以及供试品的色谱图见图1。

图1 土荆皮乙酸样品含量高效液相色谱图

2．2 溶液的制备

2．2．1 对照品溶液的制备 精密称取减压干燥12 h的土荆皮乙酸对照品6．42 mg，置100 ml量瓶中，甲醇定容（作为储备液），摇匀，精密吸取1 ml置10 ml量瓶中甲醇定容，得浓度为 6．42 μg／ml的对照品溶液。

2．2．2 供试品溶液的制备 精密称取土荆皮粉末 （过三号筛）0．5 g，置于 10 ml烧杯中加水 5 ml，浸泡 2 h，加入 90%乙醇溶液6 ml，按照正交设计条件分别提取，过滤，洗涤甲醇5 ml×3，合并滤液、洗涤液，转移至50 ml量瓶中丙酮定容，即得。

2．3 线性关系考察 分别精密吸取 2．2．1项下储备溶液0．5、1．0、4．0、6．0、8．0、10．0 ml置于 10 ml量瓶中甲醇定容，得到 3．21、6．42、38．52、51．36、64．2 μg／ml溶液。按 2．1 项下色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标进行线性回归，得回归方程：Y＝3．4087×103X＋6．025×103，r＝0．9998。结果表明土荆皮乙酸浓度在 3．21～64．2 μg／ml范围内呈良好线性关系。

2．4 精密度实验 取土荆皮乙酸对照品溶液 （6．42 μg／ml）按“2．1”项下色谱条件重复进样 6 次，20 μl／次。结果，RSD＝1．19%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2．5 稳定性实验 取同一供试品溶液，在上述色谱条件下分别于 0、2、4、6、8 h 进样 1 次，20 μl／次，记录峰面积，RSD为2．12%（n＝5），表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2．6 重复性实验 精密称取同一批 （批号：120912）样品6份，每份约 0．5 g，按“2．2．2”项下供试品溶液制备方法制备，精密吸取 20 μl，按照“2．1”色谱条件测定，记录峰面积，测定含量。土荆皮乙酸的含量分别为 0．40%、0．43%、0．41%、0．38%、0．37%、0．42%，均值 0．40%，RSD 为 2．11%（n＝6），表明方法重复性良好。

2．7 加样回收率实验 精密称取已知土荆皮乙酸含量的土荆皮（批号：120912）9 份，约 0．5 g／份，按照不同提取方法分3组，3份／组，分别精密加入土荆皮乙酸对照品溶液0．8、1．0、1．2 ml，按照“2．2．2”项下方法分别处理，测定含量，并计算回收率，结果平均回收率分别为 100．75%、100．67%、103．58%，RSD 分别为 2．48%（n＝3）、1．66%（n＝3）、2．32%（n＝3），表明三种方法回收率良好。见表1。

表1 加样回收率考察结果

2．8 样品分析 样品提取率测定按照“2．2”项下制备供试品溶液，按照“2．1”色谱条件测定，记录峰面积，利用线性方程计算土荆皮乙酸的含量

3 实验方法的优化

3．1 渗辘法正交设计 用正交实验优选渗辘法最佳提取工艺，选用影响提取效果的乙醇提取液浓度（A）、固液比（B）、提取时间（C）为考察因素，每个因素各选3个水平，以土荆皮乙酸提取率为指标，按正交设计L9（34）表进行土荆皮乙酸渗漉提取实验。因素水平见表2；正交实验结果见表3；方差分析结果见表4。比较极差，选择的提取条件为A3B3C2，以90%乙醇为提取溶剂，提取48 h，渗辘提取2次。

表2 渗辘法提取工艺正交实验因素水平

表3 渗辘法提取工艺正交实验结果

表4 渗辘法提取工艺正交实验结果方差分析

3．2 超声法正交设计 用正交实验优选超声法最佳提取工艺，选用影响提取效果的乙醇提取液浓度（A）、固液比（B）、超声时间（C）为考察因素，每个因素各选3个水平，以土荆皮乙酸提取率为指标，按正交设计L9（34）表进行土荆皮乙酸提取实验。提取工艺正交设计因素水平见表5；正交实验结果见表6；正交实验结果方差分析见表7。比较极差，选择提取条件为A3B3C2，即提取液浓度90%，固液比1∶12，超声提取时间20 min。

表5 超声波醇提工艺正交实验因素水平

表6 超声波醇提工艺正交实验结果

表7 超声波醇提工艺正交实验结果方差分析

3．3 回流法正交设计用正交实验优选回流法最佳提取工艺，选用影响提取效果的乙醇提取溶剂（A）、提取时间（B）和提取次数（C）为考察因素，每个因素各选3个水平，以土荆皮乙酸提取物回收率为指标，按正交设计L9（34）表进行土荆皮乙酸提取实验。因素水平见表8；正交实验结果见表9；方差分析结果见表10。比较极差，选择醇提条件为A1B1C3即提取液浓度60%，固液比1∶8，提取时间60 min。

3．4 工艺验证实验 精密称取土荆皮粉末0．3 g按最佳醇提工艺重复实验5次，分别按照正交优选的最佳提取条件即：渗漉法（A3B3C2）、超声波提取法（A3B3C2）、回流法（A3B1C3）进行工艺验证。验证结果见表11。

表8 回流醇提工艺正交实验因素水平

表9 回流醇提工艺正交实验结果

表10 回流醇提工艺正交实验结果方差分析

表11 不同醇提工艺验证实验结果（n＝5）

4 讨 论

本文采用的 HPLC法测定土荆皮乙酸含量，是参照中国药典2010年版一部土荆皮项下的方法，流动相做了适当调整，能达到有效分离，峰型好。标准曲线研究显示土荆皮乙酸进样量在 3．21～64．2 μg／ml范围内线性关系较好［6－8］。

本实验采用渗漉、超声波、回流三种提取方法，选用价格相对较低、毒性小的乙醇作为溶剂，考察不同提取方法对土荆皮乙酸提取率的影响。结果显示在最佳提取条件下三种方法均能较完全的提取土荆皮中土荆皮乙酸，其中超声波提取具有操作简单，提取效率高；渗漉法提取溶剂消耗量大，能耗高但更适合大批量的提取［9］。

为全面研究土荆皮乙酸的提取方法，笔者亦采用水煮醇沉法。发现土荆皮乙酸色谱峰出现明显的肩峰，笔者认为过高温度（100℃）能使土荆皮乙酸结构发生变化，其原因可能与分子内内酯环的稳定性有关［10］。本文结果表明，水浴加热在80～82℃，回流提取60 min未见明显肩峰，表明在该温度范围内土荆皮乙酸稳定性较好，可用于土荆皮乙酸的提取［11］。

［1］徐云辉，张 帅，张 念，等．土荆皮抗真菌化学成分研究［J］．中草药，2012，43（2）：220．

［2］刘 鹏，徐 曼，郭洪祝，等．土荆皮乙酸的代谢产物和代谢途径［J］．药学学报，2011，46（11）：1361－1365．

［3］李晨光．土荆皮乙酸抗肿瘤机制的研究进展［J］．天津药学，2001，13（6）：9－10．

［4］宋永峰，陈 虹，李灵芝．土荆皮的研究进展［J］．天津药学，2001，13（6）：9－10．

［5］侯 丽，崔景荣．土荆皮乙酸抗肿瘤作用及其分子机制的研究进展［J］．中国药学杂志，2010，45（23）：1810－1812．

［6］陈 桦，冯柏康，李艳园，等．高效液相色谱法测定土荆皮药材中土荆皮乙酸的含量［J］．中药材，2006，29（5）：451．

［7］焦守国，许学丽．HPLC法测定金乌骨通胶囊中淫羊藿苷的含量［J］．解放军药学报，2009，25（6）：547．

［8］张强祖，杨 进．反相高效液相色谱法测定茄根中绿原酸含量［J］．时珍国医国药，2010，21（6）：1342－1343．

［9］童 玲，欧阳湘云，韩玉波，等．微波助提取及HPLC检测杜仲叶中的绿原酸［J］．分析试验室，2008，27（5）：127．

［10］何锦钧，陈 华．正交试验优选通淋口服冻干颗粒的提取工艺［J］．中药材，2010，33（5）：813－815．

［11］国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［S］．中国医药科技出版社，2010．17．