ACE2/Ang-(1-7)改善肝细胞糖代谢

曹 曦 杨芳远 史婷婷 谢荣荣 信 中 杨金奎*

(1.首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科，北京100730;2.糖尿病防治研究北京市重点实验室，北京100730)

肾素-血管紧张素系统(rennin-angiotensin system，RAS)已被证实参与并促进胰岛素抵抗的发展［1-3］。血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)-血管紧张素(1-7)〔Ang-(1-7)〕-Ang-(1-7)受体(MAS)轴作为RAS的一个负调节轴，可能对2型糖尿病的发展起到一定的保护作用［3-4］。肝脏是胰岛素抵抗发展过程中的主要器官之一，已经证实ACE2在肝脏中表达［5］。本文将在细胞水平进一步研究ACE2/Ang-(1-7)对HepG2细胞糖代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

HepG2细胞购自中国协和医科大学细胞资源中心(Cell Resource Center，IBMS，CAMS/PUMC)，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM进行体外培养(100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素)，接种并置37℃、5%CO2饱和湿度的CO2孵箱内培养，每2 d胰酶消化传代。

1.2 质粒的构建和转染

大鼠ACE2基因构建到pcDNA3.1/myc-His(-)B(PCDB)(Sino-Geno Max，China)载体上。质粒DNA采用Lipofectamine TM 2000(Invitrogen公司，美国)脂质体转染法，根据转染试剂盒操作说明转染HepG2细胞。以pcDNA3.1空载体转染HepG2细胞作为对照组。细胞转染48 h后用于后续实验。

1.3 RNA的提取和实时定量RT-PCR

应用Trizol法抽提HepG2细胞总RNA(Invitrogen公司，美国)，以2 mg RNA为模板利用Rever TraAceq PCR RT试剂盒(Toyobo公司，日本)反转出cDNA。利用ABI GeneAmp 5700PCR系统(Applied Biosystems公司，美国)，SYBR Green PCR master mix反应液检测RNA的表达。经分析系统进行相关表达的定量。引物序列如下表:

表1 RT-PCR引物Tab.1 Primers for RT-PCR

1.4 ROS 检测

HepG2 细胞用 H2O2(250 μmol/L)刺激 5 min，之后用 Ang-(1-7)(10 nmol/L)或 A779(1 μmol/L)处理1 h。二氢乙啶(Dihydroethidium，DHE)检测:培养的细胞用5 μmol/L DHE(Sigma公司，美国)在37℃黑暗中孵育40 min，磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗涤2次，用胰蛋白酶消化，并悬浮在1 mL PBS，立即用流式细胞仪(Biosciences公司，美国)读取荧光强度，激发光为500 nm，发射光为530 nm。

1.5 Western blotting

在4℃条件下，加入裂解液提取HepG2细胞蛋白。用BCA Protein Assay Kit测定样品蛋白浓度。每个样本取30～60 μg蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，用含5%(质量分数)脱脂奶粉的TBST溶液封闭4 h，加入一抗于4℃孵育过夜。TBST漂洗2次，每次5 min，加入1∶5 000辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，TBST漂洗6次，每次5 min，肌动蛋白(actin)为内参，将膜用化学发光试剂孵育1 min，于X胶片上曝光，常规显影、定影。将结果用Gelpro3.2软件进行密度分析。P67phox、p22phox购自美国Santa Cruz公司。

1.6 统计学方法

运用Prism5(GraphPad Software)进行统计分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示，组间比较使用t检验或方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACE2改变糖异生相关基因表达

RT-PCR检测ACE2过表达细胞中PEPCK和G6Pase mRNA的表达量。结果显示，ACE2过表达细胞中PEPCK的表达水平与对照组相比显著降低(P＜0.01)，而G6Pase与对照组相比，差异无统计学意义，详见图1。

2.2 ACE2改变HepG2细胞中糖代谢相关基因表达

RT-PCR检测过表达细胞中 Glut2、IRS-2、AMPKα2和 SOCS-3 mRNA的表达量。结果显示，ACE2过表达细胞中Glut2、IRS-2和AMPKα2的表达水平与对照组相比显著增高(P＜0.01)，而SOCS-3与对照组相比表达量显著降低，详见图2。

图1 ACE2对HepG2细胞糖异生基因表达的影响Fig.1 The effect of ACE2 on gluconeogenesis genes expression in HepG2 cells

2.3 Ang-(1-7)减低细胞中ROS的产生

用DHE检测HepG2细胞内ROS浓度，用Ang-(1-7)或A779预处理细胞1 h后，用流式细胞仪检测发现，Ang-(1-7)显著降低HepG2细胞内ROS的浓度，A779显著增加HepG2细胞内ROS的浓度。在H2O2处理下，Ang-(1-7)显著降低HepG2细胞内ROS的浓度，详见图3。

图2 ACE2对HepG2细胞糖代谢相关基因表达的影响Fig.2 The effect of ACE2 on glucose metabolism gene expression in HepG2 cells

图3 Ang-(1-7)降低HepG2细胞内ROS浓度Fig.3 Ang-(1-7)reduces ROS production in HepG2 cells

2.3 激活ACE2/Ang-(1-7)减低NADPH相关亚基表达水平

进一步研究显示，Ang-(1-7)能显著降低HepG2细胞内NADPH亚基p67和p22的表达。此外，Western blotting检测结果也显示，ACE2过表达，也能显著降低HepG2细胞中p67和p22的表达，同时，ACE2对氧化应激的保护作用能被A779抑制，详见图4。

3 讨论

肝脏胰岛素抵抗被认为是2型糖尿病的主要原因之一［6］。研究［7-8］表明，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在胰岛素抵抗的发生过程中发挥着重要作用。ACE2将AngⅡ分解为Ang-(1-7)，Ang-(1-7)通过其受体MAS抑制AngⅡ信号。MAS缺乏的FVB/N小鼠表现出糖耐量受损，降低胰岛素抵抗［9］，提示Ang(1-7)信号在2型糖尿病和代谢综合征中的作用。ACE2在多种疾病中起到负调节RAS的作用［10］。Zucker肥胖糖尿病大鼠的胰岛中ACE2蛋白表达升高［11］，高糖诱导下ACE2基因敲除的小鼠胰岛素抵抗加剧［12］。这些数据提示ACE2在预防胰岛素抵抗中的作用。本研究支持了这一观点，ACE2改善肝脏糖代谢相关基因的表达。

图4 ACE2/Ang-(1-7)降低HepG2细胞中NADPH相关亚基的表达Fig.4 ACE2/Ang-(1-7)reduce NADPH expression in HepG2 cells

ROS可通过多个过程产生，如线粒体电子传递链、一氧化氮合酶、黄嘌呤氧化酶，以及NOX家族的NADPH 氧化酶［13］。最近的很多研究［14-16］都在关注NOX酶在胰岛素抵抗中的作用。在骨骼肌细胞，血管紧张素Ⅱ诱导的NADPH氧化酶的活化损害胰岛素信号［14-15］。ACE2-Ang-(1-7)-MAS 轴，作为 RAS 的一个负调节轴，可能通过抗氧化作用以减少胰岛素抵抗［16］。本研究结果支持这一观点，在HepG2细胞中，ACE2/Ang-(1-7)能通过抑制NADPH氧化酶的表达减低氧化应激作用，对肝脏氧化应激有保护作用。

在本研究中，笔者使用HepG2细胞作为模型细胞研究ACE2/Ang-(1-7)对肝脏胰岛素抵抗的影响。众所周知，AMPK是一个能量传感器，它调控糖脂代谢［17］。AMPKα2 的 活 性 与 胰 岛 素 抵 抗 相 关［18］。HepG2细胞已被证实通过AMPK调节胰岛素信号通路和糖代谢相关基因的表达［19］。本研究结果支持这一观点，ACE2诱导 AMPKα2的表达，糖异生基因(PEPCE和G6Pase)表达受到抑制，而Glut-2和IRS-2等糖代谢相关基因表达量增加。

SOCS-3属于SOCS蛋白家族，SOCS-3通过结合胰岛素受体的磷酸化位点来竞争性干预其他含有SH2结构域蛋白的相互结合［20］。此外，在肝脏中，诱导SOCS-3的表达是白介素-6介导的胰岛素抵抗的重要机制之一［21］。综合上述研究，笔者推测，ACE2/Ang-(1-7)抑制 SOCS-3的表达，进而 SOCS-3抑制IRS-2和AKT磷酸化的能力降低，从而能改善胰岛素抵抗。这也可能是ACE2/Ang-(1-7)改善肝脏糖代谢的又一机制。

综上所述，本研究结果表明，激活ACE2/Ang-(1-7)可调节肝脏糖代谢相关基因的表达，这些基因表达量的改变对肝脏胰岛素抵抗有保护作用。而这一过程可能是通过减低氧化应激水平，或是通过AMPKα2和SOCS-3的调控作用来实现的。本研究结果进一步明确了ACE2/Ang-(1-7)在肝脏糖代谢过程中的作用，并为ACE2/Ang-(1-7)在胰岛素增敏机制中的作用提供了新的线索。

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