大鼠慢性脑缺血认知、情绪及小胶质细胞的变化

王丽晔 林 参 赵海苹 张陈诚 闫 峰 陈志刚 王荣亮 王宁群 罗玉敏*

(1.首都医科大学宣武医院脑血管病研究室 北京市老年病医疗研究中心，北京100053;2.北京中医药大学第二临床医学院东方医院脑一科，北京100078)

慢性脑缺血是临床常见病、多发病，且迁延日久使脑组织出现神经元变性、胶质细胞增生等一系列改变，伴随出现认知障碍等症状，也是Binawanger病、缺血性卒中等多种疾病发生过程的重要环节。目前是神经病学及神经科学众多学者的重点研究方向，但其动物研究模型制作方法及制作时间具有很大争议［1-2］。本研究选用国际常用的大鼠双侧颈总动脉永久性结扎(permanent，bilateral common carotid artery occlusion，BCCA)模型稍做改良，选取42 d及56 d两个时间点，通过观察其认知、情绪的行为学改变，小胶质细胞及大体组织状态变化确定评估时间点，在模型制作时间上为慢性脑缺血实验研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级雄性SD大鼠80只，体质量280～300 g，购于北京维通利华实验动物公司，实验动物许可证号:SCXK(京)2012-0001。分笼饲养于SPF级动物室，造模前12 h禁食不禁水。大鼠造模后采用抽签法随机分为4组:42 d-Sham(n=12)、42 d-Model(n=18)、56 d-Sham(n=12)及56 d-Model(n=18)。

1.2 主要仪器及试剂

大鼠手术操作台、小动物呼吸机(美国Harvard Apparatus 683)、显微镜(Carl Zeiss公司，德国)、显微手术器械、摇床(江苏TS-1/TS-8)、免疫荧光显微镜(日本 Nikon digital imaging hero eclipse 80i)、化学发光仪(上海 Chemi Scope)。

苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)、Anti Iba1(Wako公司，日本)、Anti NeuN(Millipore公司，美国)、FITC标记山羊抗小鼠 IgG及Cy3标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 动物模型制作方法

所有动物适应性喂养2～3 d后，采用Torre的方法［3］复制慢性脑缺血大鼠模型。大鼠称质量后用5%恩氟烷混合70%N2O、30%O2诱导麻醉，1% ～2%恩氟烷混合70%N2O、30%O2维持麻醉。仰位固定，常规备皮，颈正中切口，分离双侧颈总动脉、迷走神经，分别于剥离出的颈总动脉近心端及远心端用“4”号手术线结扎双侧颈总动脉2次，完全阻断颈总动脉血流。术中肛温保持在36.5～37.5℃，缝合皮肤后放回动物房饲养。Sham组只分离双侧颈总动脉，不结扎，其余处理同手术组。

1.4 行为评估方法

利用Morris水迷宫和新旧物体识别实验对大鼠认知能力进行评价，利用旷场试验对大鼠行为状态及情绪状态进行评价。

1.4.1 Morris水迷宫行为测试

1.4.2 新旧物体识别

取材前3 d进行新旧物体识别试验，参照Hattiangady等［5］试验方法。分为适应期、熟悉期及识别测试期，均以每只每天5 min进行训练测试。适应期为空场适应，熟悉期将两物体放置于空场内使大鼠识别，测试期将熟悉期的两物体之一换为新物体，并记录大鼠在测试期内对两物体的探索时间(以嘴凑近物体约2 cm范围内计时，鼠爬在玩具上玩或者只是在物体附近走不计入)。定义(N-F)/(N+F)×100%为探索时间分辨指数(discrimination index，DI)，用来评价大鼠记忆能力，其中N指探索新物体时间，F指探索旧物体时间。

1.4.3 旷场试验

于取材前1 d采用旷场实验评定大鼠运动状态及情绪表现。参照Xiong等［6］实验方法，自制木质旷场箱，长×宽×高为120 cm×120 cm×60 cm。内侧壁及底面为蓝灰色，用不锈钢线内嵌划分为24 cm×24 cm面积相等的25块。实验前先置大鼠于测试实验室内适应5 min。次日观察大鼠活动情况，记录5 min内大鼠总穿格数、直立次数、修饰次数以及排便次数。

1.5 组织制备

分别在相应时间点处死各组大鼠，即42 d-Model和42 d-Sham于造模后42 d处死大鼠，56 d-Model和56 d-Sham于造模后56d处死大鼠。经10%(质量分数)水合氯醛溶液3.5 mL/kg腹腔注射麻醉后，以0.9%(质量分数)氯化钠注射液心脏灌注200 mL/只，断头取脑。于视交叉处将全脑切为前后两部分，留取小脑方向的后部分，并浸泡于4%(质量分数)多聚甲醛溶液中固定3 d，后置于20%(质量分数)蔗糖溶液中脱水2 d，备用。

1.6 脑组织冰冻切片苏木精-伊红HE染色

用LeicaCM 1900型冰冻切片机，切取海马处8 μm厚切片，HE染色。将冰冻切片先后经4℃丙酮中固定10 min，苏木精染色10 min，1%(体积分数)盐酸和75%(体积分数)乙醇分化数秒，水洗20 min返蓝，伊红染色30 s等步骤后，于乙醇梯度脱水及二甲苯中透明，并以树胶封片完成。注意各步骤间水洗。高倍光镜下观察并通过摄像头将镜下图像(×600)输入计算机，观察海马部位的细胞状态。

1.7 脑组织冰冻切片免疫荧光

用LeicaCM 1900型冰冻切片机，切取海马处15 μm厚切片。4℃丙酮中固定10 min，1×PBS摇洗5 min×3次;3%小牛血清封闭非特异性抗原1.5 h，无需摇洗;滴加Iba1抗体2 h室温孵育，1×PBS摇洗5 min×3次;避光操作Cy3标记山羊抗兔IgG室温孵育30 min，1×PBS摇洗5 min×3次;DAPI封片后荧光显微镜下观察及拍摄。

1.8 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准误(±sE)表示，各数据组间比较使用单因素方差分析法和均数多重比较LSD法，水迷宫逃避潜伏期比较采用重复测量数据方差分析法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

(3)农业环境质量。农业环境是指农业生产过程中影响农业生物成长的各种自然因素或经过人工改造后的自然因素的总体，由地形、土壤、生物因素、气候、水及人为因素所组成。农业环境是农业绿色发展的基础，我国地域辽阔，各区域农业自然环境差异较大，如我国东部地区地势平缓，季风气候雨热同期，有着丰富的自然资源，有利于农业的绿色发展，而我国西北地区地势陡峭，自然环境恶劣，以温带大陆性气候为主，降水稀少，水资源短缺，不利于农作物的生长。本文使用各地区受灾面积(千公顷)与各地区耕地面积(千公顷)的比值表示农业环境质量，用x3表示。理论上，若某地区的受灾面积与耕地面积比重越大，则该地区农业环境质量越恶劣。

2 结果

2.1 慢性脑缺血对大鼠认知功能影响

2.1.1 慢性脑缺血对大鼠Morris水迷宫结果的影响

1)不同时间点慢性脑缺血后逃避潜伏期比较:本研究比较了 42 d-Model、42 d-Sham、56 d-Model和 56 d-Sham 4组的逃避潜伏期，每一组逃避潜伏期都与训练时间呈负相关，即随着时间的延长，逃避潜伏期逐渐减少。将42 d-Model和42 d-Sham组之间比较，第3天及第4天Model组逃避潜伏期较Sham组明显延长(P＜0.05，图1A);56 d-Model及56 d-Sham进行比较，从第2天开始至第4天，2组之间差异均有统计学意义(P＜0.05)，表现为Model组逃避潜伏期明显延长(图1B)。

2)不同时间点慢性脑缺血后空间探索实验结果比较:在空间探索实验中，本研究首先比较了42 d-Model、42 d-Sham、56 d-Model和 56 d-Sham 4 组的游泳速度，42 d、56 d 2时间点Model组和Sham组比较差异均无统计学意义，证明大鼠并无肢体运动功能障碍(图1C);目标象限路径百分比比较中，两时间点的Model组与Sham组相比差异无统计学意义(图1D);而在穿越平台次数的比较中，42 d及56 d Model组较其对应的Sham组均有显著减少(P＜0.05，图1E)。

2.1.2 不同时间点慢性脑缺血后新旧物体识别实验结果比较

为进一步探讨BCCA法制作的慢性脑缺血模型时间点对于认知能力下降的影响，本研究选择新旧物体识别实验对记忆力进行再测试。42 d-Model与42 d-Sham、56 d-Model与56 d-Sham之间进行比较，可见与Sham组相比，42 d和56 d 2时间点的Model组N-F/N+F值均减少，但差异无统计学意义(P＞0.05，图1F)。

2.2 慢性脑缺血对大鼠情绪影响

在旷场试验中，本研究根据直立次数、穿格次数、修饰次数及排便次数对大鼠情绪进行评价，将42 d-Model组与Sham组及56 d-Model组与Sham组比较。可见42 d、56 d的Model组与相应的Sham组相比，直立次数(图2A)及穿格次数(图2B)均具有明显的升高(P＜0.05)，其中以42 d更为明显。在修饰次数(图2C)及排便次数(图2D)比较中，Model组比Sham组有所增多，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

图1 大鼠BCCA法制作的慢性脑缺血模型42 d、56 d逃避潜伏期、游泳速度(cm/s)、目标象限路径百分比(%)、穿越平台次数及探索时间分辨指数的变化Fig.1 Changes of escape latency，swimming speed(cm/s)，target quadrant occupancy(%)，platform crossing and N-F/N+F subject to chronic cerebral ischemia caused by BCCA 42nd and 56th day

2.3 慢性脑缺血对大鼠海马组织形态影响

利用HE染色对海马CA1区和CA3区的组织形态进行观察，在光学显微镜下，42 d、56 d Sham组未见明显组织状态改变，神经细胞形态、数量分布正常，排列紧密而有序，细胞结构完整，轮廓清晰，细胞核圆而大，染色浅而均匀，核仁清晰。与之相比较，相应时间点的Model组无明显区别(图3)。

2.4 慢性脑缺血引起小胶质细胞活化

应用 Iba1免疫荧光染色对 42 d-Model、42 d-Sham、56 d-Model和56 d-Sham 4组进行染色，红色为小胶质细胞，蓝色为细胞核。分别选取海马左右两侧及皮质左右两侧作为视野观察，可见各组均有小胶质细胞阳性着色。但两时间点Model组小胶质细胞数量及形态与相应Sham组比较可见明显差别，各组内左右两侧差异不明显。42 d、56 d Sham组小胶质细胞数量较多，染色较深，胞体较小，突起较少，呈分支状，细长;42 d、56 d Model组小胶质细胞染色加深，胞体增大，突起增多、变短，呈“阿米巴样”。海马与皮质改变相近(图4)。

图2 大鼠BCCA法制作的慢性脑缺血模型42 d、56 d情绪的变化Fig.2 Changes of emotion in rats with chronic cerebral ischemia caused by BCCA 42nd and 56th day

图3 大鼠慢性脑缺血海马CA1和CA3区脑组织HE染色Fig.3 Histological morphology of CA1 and CA3 in hippocampus of rats after chronic cerebral ischemia

图4 大鼠慢性脑缺血Iba1免疫荧光染色Fig.4 Iba1 immunofluorescent staining of rats by chronic cerebral ischemia

3 讨论

慢性脑缺血可导致认知及情绪障碍［7］，动物实验可将此模型近似复制［8］，使其机制研究在动物模型中得以实现。以往研究［9-11］认为慢性脑缺血与炎性反应、氧化应激、能量代谢障碍、胆碱能系统改变等具有明显相关性，而小胶质细胞活化、神经元缺失及脑白质损害是其中重要的病理过程［12-15］。

本实验利用国际上应用较多的BCCA模型复制慢性脑缺血过程。缺血3 d为急性期，3～7 d为亚急性期，2周后即可认为是慢性期。故本实验选取42 d、56 d作为慢性脑缺血的观察时间点。Morris水迷宫在空间学习记忆能力评价中具有风向标意义，根据结果提示BCCA 42 d及56 d均可使大鼠出现明显的认知能力下降，与Cechetti等［16］的研究结果一致;新旧物体识别表现出趋势，但是无统计学意义，考虑该评价在小鼠实验中应用更为广泛，对于大鼠测评具有一定局限性，尚需完善。既往研究［17］提示BCCA大鼠可出现焦虑抑郁等情绪障碍，与之相应，旷场试验中Model组的垂直次数及穿格次数均见明显升高，提示BCCA大鼠出现焦虑样行为。进而证明42 d及56 d均可将慢性脑缺血的行为学表现完全复制。

但海马神经元的HE染色结果变化不明显，与既往研究一致，如Tian等［18］BCCA后60 d进行染色提示与Sham组相比并无明显的形态变化。考虑与模型制作时间短而神经元缺失不突出有关，也与HE染色针对性不强，对神经元损伤不敏感有关，可进一步采用尼氏染色等方法验证。而Iba1的免疫荧光表现提示BCCA 42 d及56 d均出现小胶质细胞的活化表现，印证BCCA与炎性反应密切相关。

因病理状态及表现与发病时间相应，故在慢性脑缺血研究中，出现4、8、12周及更长等不同的模型制作时间［19-21］。根据本实验结果提示，BCCA 42 d即出现认知、情绪及小胶质细胞活化，56 d表现更加突出，但HE染色未见病理变化。学者可根据自己的研究方向选择适宜的模型制作时间。

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