热量限制对C57小鼠学习记忆能力及胰岛素信号通路相关蛋白的影响

赵志炜 马丽娜 王 蓉 张 旭 王玉兰 吴燕川 陈 娟 张景燕

(首都医科大学宣武医院中心实验室北京市老年病医疗研究中心北京脑重大疾病研究院阿尔茨海默病研究所神经变性病教育部重点实验室，北京100053)

热量限制(caloric restriction，CR)是指在没有营养 不良的情况下，限制自由摄取的食物量，在1935年最早被发现［1］。热量限制已被证实能够延长多种生物的寿命，并且有研究［2］发现能够减缓与老化相关的生理机能的下降。虽然目前研究发现很多信号通路参与到热量限制的过程中，但是热量限制有益效应的具体机制仍不明确。本实验室前期研究［3］中发现热量限制能够改善糖脂代谢，而有研究［4］发现热量限制具有神经保护作用，因此，本研究通过观察不同热量饮食对小鼠学习记忆和脑内胰岛素信号通路的影响，进一步探讨热量限制对小鼠学习记忆影响的具体机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性C57小鼠30只，体质量19～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号:SCXK(京)2006-009。小鼠基础饲料适应性喂养1周后，采用数字表法将动物随机分成3组:正常对照组(喂食普通饲料)，高能量组(喂食高能量饲料)，低能量组(喂食低能量饲料)，每组10只，单笼喂养，自由饮水，饲养于SPF级动物实验室。

1.2 仪器与试剂

小鼠Morris水迷宫箱(DMS-2型，中国医学科学院药物研究所);冷冻切片机(德国Leika公司);脱色摇床(江苏TS-1型);普通光学显微镜(日本OLYMPUS BH-2型)。

1.3 Morris水迷宫实验

喂养6个月后，进行Morris水迷宫测试。Morris水迷宫系统由水迷宫装置、水迷宫图像自动采集和处理分析系统组成。水池直径100 cm，池高50 cm，池壁标有东南西北4个入水点，将水池等分为4个象限，分别称SW、NW、SE及NE象限。水深30 cm，于水下2 cm处NW象限中央(最后1 d除外)、距离池壁30 cm的固定部位放置一直径9 cm、高28 cm的柱形透明有机玻璃站台，池壁黑色，充满水时动物视觉无法辨认池内有无站台。水池上方安置带有显示系统的摄像机，同步记录小鼠运动轨迹，将其输入计算机内，通过软件分析，得到实验数据。迷宫外参照物训练期间保持不变。

实验共进行6 d，前2 d训练，后4 d测试，测试包括两部分:1)定位航行实验(place navigation):历时5 d，第1、2天上、下午各训练1次，入池位置为站台所对象限及所邻象限，于象限边1/2弧度处头朝池壁入水。120 s未找到站台者，由测试者将其引至站台，放置30 s。第3～5天重复以上操作，若120 s仍不能找到站台，则以120 s计算，不再进行引导。从第3天开始，记录找到平台所用时间(即逃避潜伏期)、游泳距离等指标。此试验用于检测小鼠的空间学习和记忆能力。

2)空间探索实验(spatial probe):定位航行试验结束后，第6天撤除平台，将小鼠从站台所对象限边1/2弧度处头朝池壁入水，记录小鼠120 s内在无平台的水迷宫中第1次穿越平台所在位置时间和在平台所在象限游泳距离及穿越平台次数。此实验用于检测小鼠对平台位置的记忆。

1.4 固定取材及冰冻切片

喂养6个月后，每组各取5只小鼠于末次行为学测试后灌杀。小鼠用10%(体积分数)的水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉成功后，将其仰卧于平台上，伸展固定四肢，打开胸腔及腹腔充分暴露心脏和肝脏。剪开左侧心尖部，经左心室插管入主动脉并固定，同时剪开右心耳。快速灌注0.9%(质量分数)氯化钠注射液150 mL左右，快速冲洗，待血液冲洗干净至肝脏完全变白，右心室流出澄清液体后，换用含4%(质量分数)多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(pH 7.2～7.4)，先快速再缓慢灌注150 mL左右至小鼠肝脏变硬肢体僵直，即固定完成。然后断头，完整取出鼠脑后投入含30%蔗糖的多聚甲醛溶液中后固定。至脑下沉后，换一次后固定液，即可行冰冻切片。

将固定好的小鼠脑组织修块，置于少量异戊烷冻存管中，再放入液氮中冷冻10 s左右，迅速放入冰冻切片机舱内，温度-25℃，包埋鼠脑，片厚20 μm，用于免疫组织化学染色，每只小鼠于海马出现后连续冠状切片。将切片放入盛有0.01 mol/L PBS溶液的24孔板内，浮片法进行免疫组织化学染色。

1.5 免疫组织化学染色(漂片法)

每组选择6张冰冻切片(厚20 μm)，PBST洗，5min×3次，用3%H2O2室温孵育10 min;PBST洗，5 min×3次，用与二抗相同来源动物的浓度为5% ～10%(质量分数)的封闭用正常血清(此实验中为正常山羊血清)封闭非特异性抗原30 min，加入适当稀释的一抗，4℃过夜;PBST洗，5 min×3次，加入生物素标记的适当稀释的二抗室温孵育2 h;PBST洗，5 min×3次，加入适当稀释的链酶菌抗生物素蛋白-过氧化酶三抗，室温孵育2 h;PBST洗，5 min×3次，DAB显色，镜下控制显色程度，自来水终止显色反应。捞片;用二甲苯透明，中性树胶封片。

阴性对照分别以洗液和非免疫的正常山羊血清代替一抗进行免疫组织化学染色，其余步骤同前。阳性反应为组织细胞内呈棕黄色染色。

每组小鼠例数为5只，每只取6张相应部位的脑切片，共取30张切片，用显微镜观察海马部位的神经细胞形态，并于10倍物镜下计数海马的阳性细胞数。

1.6 统计学方法

使用SPSS 16.0进行统计处理。计量资料用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析及重复资料的方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 饮食限制对空间学习、记忆的影响

在用Morris水迷宫测试小鼠空间学习记忆能力试验中，将小鼠游泳逃避潜伏期和游泳距离作为学习记忆的指标进行对比。由表1可以看出，与正常组相比，高能量组和低能量组差异无统计学意义(F=0.979，P=0.389)，但高能量组逃避潜伏期时间有明显增长趋势，低能量组逃避潜伏期时间有明显缩短趋势，与高能量组相比，低能量组第3天、第4天、第5天逃避潜伏期都有不同程度的缩短。

表1 Morris水迷宫逃避潜伏期Tab.1 Escape latency of Morris test (s)

由表2可以看出，对游泳距离进行统计学分析，与正常组相比，高能量组游泳距离长，低能量游泳距离短，但各组之间比较，差异无统计学意义(F=1.286，P=0.293);与高能量组相比，低能量组第3天游泳距离明显缩短(P＜0.05)，低能量组第4天、第5天游泳距离与高能量组相比都有不同程度的缩短。

表2 Morris水迷宫游泳距离Tab.2 Swimming distance of Morris (mm)

与正常组相比，高能量组和低能量组差异均无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 免疫组织化学法检测小鼠海马神经元SIRT1、IGF-1、IR、IRS-1、PI3K、Akt/PKB、p-CREB 的表达

由表3可以看出，与正常组相比，低能量组SIRT1、IGF-1、IR、IRS-1、PI3K、Akt/PKB、p-CREB 降低(P＜0.01)，高能量组PI3K、Akt/PKB降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

热量限制是一种有计划地减少由食物供给的热量，一般是在保证足够的维生素和矿物质水平下，将正常自由进食的热量减去30%～50%。研究［2-5］显示热量限制可以预防或减缓年龄相关的病理变化。热量限制具有神经保护作用，因此可以延缓对神经退行性疾病例如阿尔茨海默病的进展［6-7］。但热量限制对于学习记忆能力的影响及其机制目前少有研究。

表3 各组动物免疫组化结果Tab.3 Immunohistochemistry of the three groups

本研究采用Morris水迷宫测试小鼠空间学习记忆能力，研究显示高能量组逃避潜伏期时间有明显增长趋势，低能量组逃避潜伏期时间有明显缩短趋势;与高能量组相比，低能量组第3天逃避潜伏期明显缩短(P＜0.05)。提示热量限制能够改善小鼠的学习记忆能力。Morris水迷宫发明于20世纪80年代初，它能比较客观地衡量动物空间记忆，工作记忆及空间辨别能力的改变，是检测实验动物学习记忆的重要工具，由于其简便易行，检测结果客观，而广泛用于空间学习记忆功能的研究［8］。因此，本研究采用Morris水迷宫来评价饮食限制对小鼠空间学习记忆能力的影响。本研究结果显示，与正常组相比，高能量组小鼠逃避潜伏期和游泳距离虽无统计学差异但都有所延长，提示高能量组小鼠存在一定的学习记忆障碍。

本研究显示低能量组小鼠脑内胰岛素信号通路相关蛋白烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的组蛋白脱乙酰酶(silent mating type information regulation 2 homolog-1，SIRT1)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、胰岛素受体(insulin receptor，IR)、胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)、磷脂肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt/PKB)、磷酸化应答原件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，p-CREB)的表达均明显降低(P＜0.01)。胰岛素是人体胰岛分泌的重要激素，不仅参与能量代谢的调节，对神经细胞还具有营养支持和抗凋亡的作用。它能促进神经元增殖和树突芽生，在应激状态下保护神经元，增强学习和记忆能力，与中枢的学习和记忆功能密切相关。胰岛素作用是通过与相应的受体结合激活不同的信号通路来实现的。因此研究胰岛素信号转导通路对学习记忆尤为重要。目前胰岛素信号通路主要有3条:磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)PI3K/AKT通路、细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，ERK)/促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路和磷脂酶 C(phospholipase，PLC)途径。本研究重点在于观察PI3K/AKT通路蛋白表达的变化，观察的靶蛋白主要包括 SIRT-1、IGF-1、IR、IRS-1、PI3K、Akt/PKB、p-CREB等指标。胰岛素在体内发挥作用机制复杂，胰岛素到达相应的靶细胞以后，与靶细胞膜表面的胰岛素受体(insulin receptor，IR)的α亚基结合，激活β亚基，导致受体自动磷酸化，从而引起胰岛素受体底物(insulin receptor substrate，IRS)的酪氨酸磷酸化，磷酸化的IRS-1可激活PI3K，引起PI3K的活性升高，使 Akt/PKB磷酸化，最终可使CREB磷酸化，促使基因转录和神经元存活以及胰岛素的其他功能［9］。但仍有研究［10-11］显示热量限制对认知行为没有影响或者使其下降，因此，热量限制对学习记忆功能的影响存在很多争议［12-14］，但是不同研究的不同结果的原因可能由于实验条件、动物种系及测量学习记忆功能方法的不同。本研究对于热量限制改善学习记忆功能提供了机制方面的证据支持，关于热量限制与胰岛素信号通路及其他信号通路更深入的关系仍待于进一步的研究。

总之，热量限制可以提高C57小鼠的学习记忆功能，并且改善脑内胰岛素信号通路，由此提示热量限制可能通过改善脑内胰岛素信号通路从而提高学习记忆功能，从而为治疗年龄相关的疾病例如阿尔茨海默病提供可能的治疗方案。

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