神经生长因子对颅脑外伤大鼠的抗炎作用机制

吕秋石，郭芮兵，姜永军，叶瑞东，樊新颖，马敏敏，李 芸，徐格林，刘新峰

0 引 言

颅脑外伤(traumatic brain injury，TBI)会引发一系列神经系统功能紊乱，从而致残或者致死［1-2］。TBI所致的损害可分为原发性和继发性，后者更为严重，主要包括炎症反应、细胞的坏死和凋亡以及蛋白变性或异常沉积等［3］。因而积极控制外伤后的炎症反应，有益于改善预后［4-5］。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)可减轻大鼠脑外伤后的相关损伤［6-7］，但其相对分子质量大，难以通过血脑屏障，脑组织内利用率低，经鼻给药方式可绕过血脑屏障作用［8-9］。本研究旨在讨论经鼻给予NGF对TBI大鼠炎症反应的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康成年雄性 SD大鼠，体重280～310 g，共36只，由我院实验动物中心提供，实验动物许可证号:SYXK(军)2007-09。标准饲养环境下饲养。造模成功后按随机数字表法分为假手术组、TBI模型组、治疗组，每组12只。兔抗大鼠β-淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ42)多克隆抗体(1∶100，Abcam公司，美国)，兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体(1∶1000，Cell Signaling Technology公司，美国)，生物素化的山羊抗兔IgG二抗(1∶1000，Cell Signaling Technology公司，美国)，ELISA试剂盒(均由法国Diaclone公司提供)。

1.2 实验方法

1.2.1 建立脑外伤模型 TBI模型组和治疗组采用Feeney等［10］的自由落体法。大鼠俯卧位固定于脑立体定向仪上，将撞杆置于已暴露的右侧硬膜上，2%水合氯醛以40 mg/kg剂量行腹腔内麻醉后，用40 g砝码从25cm高处沿外周导管坠落，撞击后用骨蜡封闭骨窗。假手术组不致伤，仅开颅窗后用骨蜡封闭。

1.2.2 经鼻给药 参照 Liu等［11］的经鼻给药方法，采用两侧鼻孔交替给药，当一侧鼻腔给药时，将另一侧鼻腔关闭，每次间隔约2 min，单次给药约5 μL。治疗组大鼠 TBI后6 h经鼻给予 NGF(50 g/d)，TBI模型组及假手术组则经鼻给予等量磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4 ～7.5)，每天给药 1 次，持续给药至大鼠被处死。

1.2.3 免疫印迹法检测Aβ42表达变化 各组大鼠分别于TBI后12 h和24 h各处死6只，取伤侧皮质周围的组织研磨匀浆后提取总蛋白，并检测蛋白浓度。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后，利用半干法转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h后孵育一抗，4℃过夜。经PBST洗涤后加二抗，室温下孵育1 h。化学发光后曝光显影。结果分析使用Image J软件。

1.2.4 酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测IL-1β和TNF-α 蛋白准备同免疫印迹法，操作根据ELISA试剂盒说明书进行。

1.2.5 凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)NF-κB活性 细胞核蛋白提取参照先前实验方法［12］。EMSA检测方法参照试剂盒内说明书进行:取1.75 pmol/μL未标记的双链NF-κB 寡 核 苷 酸 探 针 (5'-AGTTGAGGGGACTrrCCCAGGC-3';5'-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3')和T4多核苷酸激酶，用［γ-32P］ATP(0.37 GBq/mL)进行标记，总反应体积为25 μL(核蛋白3 μL，多聚腺苷酸一尿苷酸2 μL，［γ-32P］ATP 标记的 NF-κB 探针2μL，反应液18μL)，混匀后室温放置20 min，上样于聚丙烯酰胺凝胶样品孔中，恒压150 V电泳。电泳结束后轻轻揭下凝胶，放入暗盒中-70℃曝光、显影。

1.3 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计分析，定量数据用均数±标准差(±s)表示。采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey's post hoc法，方差不齐时采用非参数检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠脑组织的炎症反应 TBI后12 h和24 h，TBI模型组和治疗组大鼠伤侧皮质内炎症因子IL-1β、TNF-α的表达量均较假手术组大鼠明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。经鼻给予NGF后，TBI治疗组 IL-1β、TNF-α 的表达量较 TBI模型组下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.2 大鼠脑组织内NF-κB的表达 EMSA结果提示，TBI后 12 h、24 h，TBI模型组大鼠伤侧皮质内NF-κB的DNA结合活性较假手术组显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。经鼻给予NGF后，治疗组大鼠NF-κB DNA结合活性较TBI模型组显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.3 大鼠脑组织内Aβ42的表达 TBI后12h、24h，TBI模型组大鼠伤侧皮质内Aβ42的表达量较假手术组显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。而经鼻给予NGF治疗后，大鼠伤侧皮质内的Aβ42表达较TBI模型组大鼠均明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠伤侧皮质炎症因子表达的比较(±s，n=6)Table 1 The expression of inflammation in the cortex in all group(±s，n=6)

表1 各组大鼠伤侧皮质炎症因子表达的比较(±s，n=6)Table 1 The expression of inflammation in the cortex in all group(±s，n=6)

与假手术组比较，*P＜0.05;与 TBI模型组比较，#P＜0.05

IL-1β(pg/mg)TNF-α(pg/mg)NF-κB组别Aβ 24h假手术组 4.98±1.88 5.49±2.00 4.08±1.42 4.17±0.97 104.97±0.85 105.63±0.91 0.557±0.006 0.930±0.0伤后12h 伤后24h 伤后12h 伤后24h 伤后12h 伤后24h 42伤后12h 伤后15 TBI模型组 70.65±3.10* 68.85±8.10* 47.12±7.38* 56.15±11.20* 135.26±0.60* 149.86±0.49* 0.827±0.009* 1.390±0.010*治疗组 37.51±1.92*# 36.23±2.99*# 27.63±5.77*# 29.94±8.62*# 111.62±0.49*# 131.52±0.88*# 0.230±0.008*# 0.520±0.004*#

3 讨 论

我们的研究结果表明，经鼻给予NGF可抑制TBI后大鼠脑组织内Aβ42的增加，从而抑制其下游的NF-κB通路，使得炎症因子 IL-1β、TNF-α 的表达下降，最终炎症反应下调，可能改善TBI后大鼠的预后情况。

积极控制TBI后的炎症反应有助于预后的改善。炎症因子IL-β表达的增高可促进GSK-3β的活化，后者进一步促进tau蛋白的异常磷酸化，最终向阿尔兹海默症发展［13］。另外，炎症因子 IL-1β、TNF-α 的增加，会引起水通道蛋白-4(aquaporins-4，AQP-4)的表达增加，加剧TBI后的脑水肿情况［14-15］。因此，炎症反应与TBI的预后紧密相关。本文结果显示，经鼻给予NGF后，TBI大鼠脑组织内炎症因子的表达明显下降。

NF-κB 是炎症反应的调控因子［16］，NGF 通过抑制NF-κB的DNA结合活性从而抑制TBI大鼠的炎症反应。NGF对NF-κB的调节作用目前仍无明确的定论，有文献指出NGF通过与p75NTR受体结合介导NF-κB的激活［17-18］。本组结果提示经鼻给予 NGF后，TBI大鼠的NF-κB的DNA结合活性是下降的，这一作用可能与Aβ42表达的下调有关，NGF可减少脑损伤后大鼠脑组织内 Aβ42的表达［19-20］，Aβ42的下调可抑制NF-κB激活的［21-23］。本结果也表明经鼻给予NGF后，TBI大鼠的Aβ42的表达减少。有研究表明，炎症反应会增加TBI后大鼠脑内Aβ42的沉积［24］，可见Aβ42与NF-κB之间是相互作用的。

综上所述，经鼻给予NGF可控制TBI大鼠脑内的炎症反应，该作用机制可能与Aβ42/NF-κB通路相关。TBI后的炎症反应可促进Aβ42的沉积、tau蛋白的异常磷酸化、AQP-4的升高等，引发相应的并发症，通过控制炎症反应，从而可能使预后得到改善，但应用到临床治疗，仍需要大量的实验研究加以证实。

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