姜黄素抑制RPMI8226细胞增殖时丝裂原活化蛋白激酶及基质金属蛋白酶的表达

朱国华，张 琦，戴海萍，沈 群

0 引 言

姜黄素(curcumin，Cur)是从亚热带地区多年生草本植物姜黄根茎中提取的一种植物多酚，具有多方面药理作用，如抗肿瘤、抗炎和抗氧化等［1-2］。其中Cur的抗肿瘤作用日益受到学者们的关注，美国国立肿瘤研究所已将其列为第3代癌化学预防药［3］。而多发性骨髓瘤是一种起源于B淋巴细胞并能分泌大量单克隆免疫球蛋白的恶性浆细胞病。目前因其发病机制的复杂以及多药耐药的出现，多发性骨髓瘤仍是一种难治性疾病，尚需探索新的治疗药物［4］。本研究探讨Cur体外抑制人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖时丝裂原活化蛋白激酶(mitogen actived protein kinase，MAPKs)及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族的表达，初步揭示其可能的抗肿瘤分子机制，为临床多发性骨髓瘤治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 RPMI8226细胞株由江苏省人民医院惠赠;Cur购于Sigma公司，纯度≥94%;MTT试剂盒购自南京凯基生物公司;PI染色细胞周期检测试剂盒为碧云天公司产品;一抗P38 MAPK、JNK、ERK1/2、p-JNK、β-actin 均购自 Cell Signaling公司;明胶购自Sigma公司。

1.2 细胞培养及药物配制 RPMI8226细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液，并置37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每2～3天传代1次。Cur溶解于DMSO中配制成50 mg/mL储存液，-20oC保存，使用时用无血清培养液稀释至所需浓度。

1.3 MTT法测定细胞增殖抑制率 选取对数生长期的RPMI8226细胞，以1×104/mL密度接种于96孔培养板，每孔90 μL。培养2 h后根据实验要求加入不同浓度的Cur，同时设立不加药的阴性对照组及不含细胞的空白组，每组设5个复孔。分别培养24、48、72 h 后，每孔加入 MTT 工作液 50 μL，37℃继续孵育4 h，再每孔加入150 μL DMSO，振荡器振荡摇匀10 min，酶标仪490 nm测吸光度值(A490)。实验独立重复3次，计算细胞增殖抑制率，公式如下:

细胞增殖抑制率(%)=1-［(实验组A490-空白组A490)/(阴性对照组A490-空白组A490)］×100%

1.4 流式细胞术检测细胞周期 选取对数生长期的RPMI8226细胞，按5×105/mL密度接种于6孔培养板，每孔2.25mL，再分别加入Cur 250μL(终浓度为6.25μmol/L、12.50μmol/L、25.00μmol/L)，每组设3个复孔;培养48 h后离心收集1×106个细胞，PBS洗涤2次后将细胞固定于预冷的70%乙醇，4℃过夜，离心洗涤后加入500 μL PI染色工作液，并于37℃避光水浴30min后上流式细胞仪检测。

1.5 Western blot法检测凋亡相关蛋白MAPKs家族的表达 收集不同浓度 Cur(终浓度为6.25 μmol/L、12.50μmol/L、25.00 μmol/L)处理 72 h 后的各组RPMI8226细胞，PBS洗涤2次后加入适量RAPI裂解液和相关磷酸酶、蛋白酶抑制剂，冰浴30 min，4℃ 12000×g离心15 min后取上清。酶标仪测A570值，并以牛血清白蛋白为标准样品绘制标准曲线，计算各组上清中的蛋白浓度。每组各取40 μg变性后的蛋白质样品，行SDS-PAGE垂直电泳，半干电转膜法转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h后加入一抗，4℃摇床过夜;以TBST漂洗后加入二抗，常温作用2 h，再经TBST漂洗后加入ECL发光液，Image Quant LAS 4000成像仪检测并保存结果。Photoshop 6.0软件分析所得条带，计算目的基因与β-actin的灰度比值。实验重复3次，取其均值。

1.6 明胶酶谱法检测金属基质蛋白酶MMPs家族的表达 取对数生长期的RPMI8226细胞，接种于RPMI-1640无血清培养液，并加入不同浓度的Cur(终浓度为 6.25 μmol/L、12.50 μmol/L、25.00 μmol/L)。培养48h后离心收集各组无血清培养上清液，并测定上清样本中的蛋白浓度。配置含0.1%明胶的SDSPAGE胶，并按照每孔40 μg蛋白量上样，4℃ 100 V恒流电泳1.5h，至溴酚蓝染料到达胶底。取出凝胶依次置于洗脱液、漂洗液中振荡洗涤，再置于孵育缓冲液(含0.02%Brij-35)，37℃孵育42 h;取出凝胶用考马斯亮蓝R250染色3h，再经脱色液逐渐脱色至蓝色背景下显现清晰白色条带为止。拍照，并经Photoshop 6.0软件分析酶解条带灰度。

2 结 果

2.1 RPMI8226细胞增殖抑制率变化 MTT结果提示(6.25～25.00)μmol/L浓度范围内的 Cur对RPMI8226细胞均有增殖抑制作用，随着药物浓度的升高及作用时间的延长，RPMI8226细胞的增殖抑制率逐渐上升，见图1。经单因素方差分析，同一时间点上不同浓度Cur对RPMI8226细胞的增殖抑制率与阴性对照组相比，差异均有统计学意义(P＜0.01)。另外经LD 50计算软件分析得出Cur作用于RPMI8226细胞24 h、48 h及72 h的IC50值分别为15.80、12.77 和 11.02 μmol/L。

图1 不同浓度Cur对RPMI8226细胞增殖抑制的影响(n=3)Figure 1 Inhibitory effects of different concentrations of curcumin(cur)on the proliferation of RPMI 8226 cells(n=3)

2.2 RPMI8226细胞周期变化 Cur作用RPMI8226细胞48h，随着药物浓度的升高，处于G0/G1期细胞数逐渐减少，S期细胞数逐渐增多，且G2/M期细胞数也逐渐增多，见表1。经单因素方差分析得出，不同Cur浓度组G0/G1期细胞数及G2/M期细胞数的组间差异均具有统计学意义(P＜0.05)，而S期细胞数的差异无统计学意义(P＞0.05)。因此提示 Cur体外抑制RPMI8226细胞增殖，影响RPMI8226细胞周期进程，且使细胞主要阻滞于G2/M期。

表1 Cur作用RPMI8226细胞48h后细胞周期的改变(±s，%，n=3)Table 1 Cell cycle changes of RPMI8226 cells treated with different concentrations of curcumin(cur)for 48 hours(±s，%，n=3)

表1 Cur作用RPMI8226细胞48h后细胞周期的改变(±s，%，n=3)Table 1 Cell cycle changes of RPMI8226 cells treated with different concentrations of curcumin(cur)for 48 hours(±s，%，n=3)

与阴性对照组比较，*P＜0.05

组别 G0/G1期 S期 G2/M期阴性对照组50.67 ±1.28 44.54 ±0.85 4.79 ±0.15 Cur 6.25 μmol/L 44.06 ±1.39* 50.06 ±1.81 5.89 ±0.41*Cur 12.50 μmol/L 39.80 ±1.27* 52.12 ±1.53 8.09 ±0.63*Cur 25.00 μmol/L 34.39 ±1.89* 52.89 ±2.17 12.72 ±0.68*

2.3 凋亡相关蛋白MAPKs家族的表达 Western blot结果显示，不同浓度Cur处理RPMI8226细胞72 h，随着细胞凋亡率的不断增加，JNK1/2/3和p-JNK1/2/3的表达呈浓度依赖性上升，与阴性对照组相比，除Cur 6.25μmol/L处理无统计学意义，其余各浓度均具有统计学意义(P ＜0.05或P＜0.01);而ERK1/2及P38 MAPK的表达与阴性对照组相比则差异无统计学意义(P ＞0.05)。见图2、图3。

2.4 检测细胞培养上清中MMPs的表达 明胶酶谱法分析不同浓度Cur处理RPMI8226细胞48 h后细胞上清中的明胶酶，结果可见在蓝色背景下出现2条相对分子质量分别为72 000、92 000的溶解带，分别是酶原形式的MMP-2(Pro-MMP-2，72000)及酶原形式的 MMP-9(Pro-MMP-9，92 000)，见图4。后经Phtoshop灰度扫描并统计分析，MMP-2和MMP-9的表达呈药物浓度依赖性下降，与阴性对照组相比，Cur 12.50 μmol/L 和 Cur 25.00 μmol/L 处理后均有统计学意义(P ＜0.01)，见图5。

图2 Cur作用RPMI8226细胞72 h后MAPKs的表达Figure 2 Expressions of JNK1/2/3，p-JNK1/2/3，ERK1/2and P38-MAPK in RPMI8226 cells treated with curcumin for 72 hours

图3 Cur作用RPMI8226细胞后MAPKs表达的统计学分析Figure 3 Protein expression of MAPKs/β-acti in RPMI8226 cells treated with different concentrations of curcumin(cur)

图4 Cur作用RPMI8226细胞48 h后细胞上清中MMPs的表达Figure 4 Zymogen expressions of MMP-2 and MMP-9 in RPMI8226 cell supernatant treated with curcumin for 48 hours

图5 Cur作用RPMI8226细胞后细胞上清中MMPs表达结果的统计分析Figure 5 Zymogen expressions of MMP-2 and MMP-9 in RPMI8226 cell supernatant treated with different concentrations of curcumin(cur)

3 讨 论

MAPKs家族主要包括3个成员:ERK1/2、JNK和P38 MAPK，是将细胞外信号转导至胞内或核内的重要使者，引起诸如细胞增殖、分化、转化及凋亡等生物学事件［5-6］。其中ERK1/2通常被认为参与Ras-Raf-MAPK信号转导途径，在生长因子介导的细胞增殖和分化过程中发挥重要作用，并可阻止细胞凋亡。而JNK与P38MAPK同属应激激活的蛋白激酶，在紫外线照射及药物刺激作用下发生活化［7］。活化后的JNK可磷酸化c-Jun，活化转录因子-2，激活转录因子AP-1，且使FasL表达增强，促进细胞发生外源性死亡受体途径的凋亡;另外活化的JNK还可磷酸化Bcl-2和Bcl-xL，促进线粒体释放Cyto C，从而激活Caspase级联反应，导致细胞发生内源性线粒体途径的凋亡［8］。而P38 MAPK信号通路一般认为与JNK具有相同底物，可增强c-myc表达、p53磷酸化，在Fas/FasL介导的细胞凋亡中发挥类似作用［9-10］。

本研究将 6.25 ～25.00 μmol/L Cur体外作用于RPMI8226细胞，胞内JNK1/2/3和p-JNK1/2/3的表达均呈浓度依赖性上升;而ERK1/2及P38 MAPK的表达与阴性对照组相比均无明显改变。表明MAPKs家族的3个成员中，可能仅JNK参与Cur诱导RPMI8226细胞的凋亡过程，其具体分子机制还有待对JNK信号通路上下游分子的进一步研究，如需要进一步检测ASK1、MEK、MKK4/7、Fas/FasL、p53、caspase3/8/9 等蛋白的表达［11］。

另外MMPs是一组锌离子依赖性蛋白水解酶家族，其中明胶酶MMP-2与MMP-9是细胞外基质降解和重构的主要作用者，与肿瘤入侵和转移的关系最为密切［12-13］。而近年来也有研究表明，一定浓度的Cur可抑制实体肿瘤细胞如肾癌786-O、卵巢癌细胞CaOV3、食管癌EC9706等的浸润与转移［14-15］。本研究通过明胶酶谱法检测到RPMI8226细胞培养上清中MMP-2及MMP-9的活性呈Cur药物浓度依赖性下降，表明一定浓度的Cur还可能抑制RPMI8226细胞的浸润与转移。总之，本研究证实 Cur在6.25～25.00μmol/L浓度范围内对RPMI8226细胞有明显的增殖抑制作用，阻滞RPMI8226细胞于G2/M期。其具体的抗肿瘤机制，一方面可能激活MAPKs家族的JNK信号通路，体外诱导RPMI8226细胞的凋亡;另一方面 Cur还可能通过抑制 MMPs的活性，影响RPMI8226细胞的浸润与转移。

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