扬子鳄与大鼠延髓神经元型一氧化氮合酶阳性神经元的分布比较

李怀斌，吴 锋，龚 鑫，熊克仁

(皖南医学院 人体解剖学教研室，安徽 芜湖 241002)

扬子鳄是我国特有的珍稀动物，被列为国家一级重点保护野生动物，2000年世界自然保护联盟(IUCN)红色名录中将其列为极危级(CR)，成为全球23种鳄中最濒危的鳄类［1］。扬子鳄在进化过程中处于由水生到陆生的关键过渡阶段，近年来，人工繁殖的扬子鳄数量不断增多，但野生扬子鳄野外生存数量仍在急剧减少，依然处于濒危状态，形势十分严峻［2］。因此，从各方面、各层次加强开展对扬子鳄的科学研究，显得尤为重要。我室曾采用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶(NADPH-d)法对扬子鳄端脑、中脑的一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元进行了观察研究［3－4］。有研究表明大鼠延髓有NOS阳性神经元的分布，延髓是呼吸中枢所在，无论是在常氧还是在缺氧条件下，延髓产生的一氧化氮(NO)在节律性呼吸活动中的调节都具有重要作用［5－6］。NOS 可 分 为 诱 导 型 (iNOS)、内 皮 型(eNOS)和神经元型(nNOS)三种亚型，在中枢神经系统中分布最多的是nNOS亚型［7］。本项目采用免疫组织化学染色方法结合计算机图像分析对扬子鳄与大鼠延髓内nNOS阳性神经元的分布和形态特征进行比较，找出二者间的分布规律和形态区别，以期为生物进化及扬子鳄种群遗传保护方面的深入研究提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 扬子鳄6只，体质量(30±5)kg，雌雄不拘;SD大鼠15只，体质量(200±20)g，雌雄不拘。

1.2 实验方法 受扬子鳄脑取材限制，两种动物再各分三次进行分次实验，每次扬子鳄2只，SD大鼠5只。各组动物在同一时间内，电击处死后，迅速取出延髓，固定于4%甲醛固定液中，固定后梯度脱水，透明，浸蜡，石蜡包埋。每组每只动物延髓的相同节段分别取连续切片5张(片厚5 μm)。常规脱蜡、脱水，微波热修复，滴加兔抗多克隆nNOS抗体(稀释比例为1∶100)，采用SABC法进行染色，DAB显色后常规脱水，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.3 结果观察 在10×10倍视野下对nNOS阳性细胞的分布部位进行观察;利用黑马病理图像分析系统对每张切片内、外侧部在10×40倍视野下进行nNOS阳性细胞计数，细胞形态分类统计，细胞大小测定(胞体最大径)和平均灰度值测定。根据参考文献［8］将阳性细胞分为大、中、小三类:小型细胞(胞体最大径﹤10 μm)，中型细胞(胞体最大径介于10～20 μm之间)，大型细胞(胞体最大径﹥20 μm)。

2 结果

2.1 扬子鳄、大鼠延髓nNOS阳性神经元的分布情况 以下部位观察到nNOS阳性神经元:扬子鳄延髓的中央管周围灰质、网状结构内核团等部位;大鼠延髓的中央网状核、外侧网状核、三叉神经脊束核、下橄榄核、孤束核、疑核、副神经核、舌下神经核等部位，所观察到的nNOS免疫阳性神经元成团块状或散在分布。见图1。

图1 扬子鳄、大鼠延髓nNOS阳性神经元(免疫组化染色，×100)Fig 1 nNOS positive neurons in the medullar oblongata for the rats and A.sinensis(IHC，×100)

2.2 扬子鳄、大鼠延髓nNOS阳性神经元分布的主要特征 大鼠比扬子鳄nNOS阳性神经元数量增多(P＜0.05)，阳性细胞染色均呈现棕黄色，主要为胞膜与胞浆染色，胞核较大呈淡染，大鼠比扬子鳄阳性细胞着色加深，细胞灰度值变小(P＜0.05)。扬子鳄、大鼠延髓的nNOS阳性神经元，胞体均以中、小型细胞为主，大型细胞相对较少，胞体轮廓和突起清晰。其中扬子鳄以椭圆形、梭形细胞为主，圆形细胞和多角形细胞均较少;大鼠以梭形、椭圆形细胞为主，圆形、多角形细胞次之。见图2，表1～3。

图2 扬子鳄、大鼠延髓nNOS阳性神经元(免疫组化染色，×400)Fig 2 nNOS positive neurons in the medullar oblongata for the rats and A.sinensis(IHC，×400)

表1 两种动物延髓nNOS阳性神经数量及灰度值比较(±s)Tab 1 Comparison of the number and gray value of nNOS positive neurons in the medulla oblongata for the rats and A.sinensis(±s)

表1 两种动物延髓nNOS阳性神经数量及灰度值比较(±s)Tab 1 Comparison of the number and gray value of nNOS positive neurons in the medulla oblongata for the rats and A.sinensis(±s)

细胞总数 灰度值类别内侧部 外侧部扬子鳄 21.33 ±3.98 22.75 ±2.46 160.15 ±11.87166.35 ±内侧部 外侧部16.21大鼠 66.07 ±7.14 64.47 ±8.59 98.22 ±7.47 98.18 ±8.77 t/t' 14.341 17.120 14.499 12.581 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 两种动物延髓不同形态nNOS阳性神经元的百分比(%)Tab 3 The shape of nNOS positive neuron in the medulla oblongata for rats and A.sinensis(%)

3 讨论

近年来的研究表明，NO是NOS催化L-精氨酸生成胍氨酸过程中同时产生的，无论在中枢或外周神经系统中都担负着重要的信息传递任务，在感觉和运动的传导、内脏活动、睡眠与觉醒以及呼吸活动的调节中起重要作用;根据NOS的性质结构及其对钙的依赖性不同，可分为两大类，即Ca2+依赖性的结构型NOS和非Ca2+依赖性的诱导型(iNOS)，前者又根据存在的部位和分子的大小不同又分为神经元型(nNOS)和内皮型(eNOS)，在中枢神经系统中分布最多的是 nNOS［7，9］。

延髓是脑干的重要组成之一，延髓内有三叉神经脊束核、孤束核、疑核、副神经核、舌下神经核等感觉、运动性中继核团，还有中央网状核、外侧网状核等参与构成上行网状激动系统，并是呼吸、心血管等生命中枢所在部位。有研究表明大鼠延髓NOS阳性神经元的分布，无论是在常氧还是在缺氧条件下，延髓产生的一氧化氮(NO)在节律性呼吸活动中的调节都具有重要作用［5－6］。我室以往对NO的研究大多采用NADPH-d组织化学方法显示NOS在扬子鳄、大鼠脑组织中的分布［3－4，8］。本实验采用免疫组织化学方法观察到扬子鳄延髓的中央管周围灰质等处均可见到成团或散在的nNOS阳性神经元分布，并对所观察到的nNOS阳性神经元的大小、形态特征进行了详细描述，本实验结果为进一步研究扬子鳄脑的形态与功能积累了一定的资料。但因至今没有扬子鳄脑的核团图谱参照，致使实验中所观察到的nNOS阳性神经元具体位于哪些核团难以作出明确描述。

扬子鳄在进化过程中处于由水生到陆生的关键过渡阶段，本实验同时取大鼠延髓相同节段进行对比观察，结果显示大鼠延髓内、外侧部的诸多核团内nNOS的表达比扬子鳄明显增多。有研究认为，在哺乳类动物大鼠脑干nNOS阳性神经元可通过其所分泌的NO对其他神经递质起调节作用，并参与内脏活动、感觉和运动的传导，以及睡眠和觉醒等脑的高级整合功能的调节，在节律性呼吸活动中的调节都具有重要作用［6，10］。本实验结果提示延髓内nNOS的表达随从爬行类到哺乳类动物的进化而相应增加，延髓nNOS阳性神经元在生物进化过程中对物种的感觉和运动的传导，内脏活动、以及睡眠和觉醒等脑的高级整合功能的调节中可能扮演了重要角色。扬子鳄与大鼠延髓内、外侧部nNOS阳性神经元的数量、细胞平均灰度值及细胞的大小形态等分布特征均存在一定差异，可能与不同物种动物执行相关功能的复杂程度有关，但确切机制有待进一步研究。

［1］王立德，吴孝兵.中国扬子鳄保护存在的主要问题及管理对策研究［J］.阜阳师范学院学报:自然科学版，2010，27(3):58－61.

［2］马捷琼，刘缠民.我国扬子鳄保护及研究近况［J］.生物学研究，2003，28(7):42 －43.

［3］李怀斌，马同军，熊克仁.扬子鳄纹状体一氧化氮合酶阳性神经元的分布［J］.皖南医学院学报，2004，23(3):170 －171.

［4］马同军，龚鑫，熊克仁，等.扬子鳄中脑视叶NOS、AChE阳性神经元的分布［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2010，19(3):283－286.

［5］沈伟哉，郭国庆，邢旭光，等.大鼠脑干神经元型一氧化氮合酶免疫阳性神经元的分布［J］.解剖学研究，2002，24(2):138－140.

［6］李自成，李丽，严亨秀，等.川芎嗪对缺氧所致大鼠呼吸效应和脑干神经元型一氧化氮合酶表达的影响［J］.生理学报，2005，57(2):147－153.

［7］GART HWAITE J.Glutamate，nitric oxide and cell-signalling in the nervous system［J］.Trend Neurose，1991，14(2):60 －67.

［8］熊克仁，郑培敏.大鼠尾壳核头部一氧化氮合酶阳性神经元区域性分布和脑缺血后变化［J］.动物学报，1999，45(1):73－79.

［9］SAXON DW，BEITZ AJ.The normal distribution and projections of constitutive NADPH-d/NOS neurons in the brainstem vestibular complex of the rat［J］.J Comp Neurol，2000，425(1):97 －120.

［10］邵韵平.一氧化氮合酶的遗传、生理研究进展［J］.生物学杂志，2011，28(5):77 －78.