复方萘甲唑啉滴眼液无菌检查方法的验证

2014-12-01余晓霞刘春霞李磊

中国实用医药 2014年30期

余晓霞刘春霞李磊

复方萘甲唑啉滴眼液为中山大学孙逸仙纪念医院配制的眼用制剂, 其主要成分为盐酸萘甲唑啉、马来酸氯苯那敏、硼酸和羟苯乙酯等, 具有减轻眼睛刺激感和结膜充血的作用,临床适用于过敏性引起的眼睛炎症。《中国药典》2010年版［1］首次将无菌检查纳入眼用制剂检查项下。因此, 需建立复方萘甲唑啉滴眼液无菌检查方法并进行验证。

1 仪器与材料

1.1 仪器一次性全封闭无菌集菌过滤器(北京牛牛基因科技有限公司)、WJ-6无菌检查仪(天津罗根科技)、303A-1生化培养箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)、SPX-100B生化培养箱(上海悦丰仪器仪表有限公司)。

1.2 试药营养琼脂培养基(批号：140308), 玫瑰红钠琼脂培养基(批号：140228), 营养肉汤培养基(批号：130521),改良马丁培养基(批号：1401222), 改良马丁琼脂培养基(批号：130910), 硫乙醇酸盐流体培养基(批号：1401152), 0.1%蛋白胨水溶液(批号：110221)。以上均来源于北京三药科技开发公司。复方萘甲唑啉滴眼液(规格：10ml/瓶, 批号：201310228、201310238、201401178, 中山大学孙逸仙纪念医院 )。

1.3 菌种大肠埃希菌(escherichia coli)［CMCC(B)44 102］,枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)［CMCC(B)63 501］, 金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)［CMCC(B)26 003］, 生孢梭菌(clostridum sporogens)［CMCC(B)64 941］, 白色念珠菌(candida albicans)［CMCC(F)98 001］, 黑曲霉(aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］, 铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)［CMCC(B)10 104］(以上菌种的冻干菌均购自中国食品药品生物检定研究院 )。

2 方法与结果

2.1 菌液制备取经30～35℃培养18～24 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物和生孢梭菌硫乙醇酸盐液体新鲜培养物, 取经23～28℃培养24～48 h的白色念珠菌液体培养物, 分别用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每毫升含菌数<100 cfu的菌悬液。取经23～28℃ 培养1周的黑曲霉斜面培养物, 加入3～5 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液, 将孢子洗脱。然后, 用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内, 用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含孢子数<100 cfu的孢子悬液。

2.2 最少检验数量、检验量的确定供试品的装量为10 ml,按《中国药典》2010版二部附录Ⅺ H无菌检查法, 结果见表1,最少检验数量应为10个；按表2, 每支供试品接入每种培养基的最少量为2 ml。

2.3 供试品管的制备取供试品30支(批号：201310228、201310238、201401178)分2份, 15支/份, 用两套一次性三联管全封闭无菌集菌过滤器, 先用少量0.1%无菌蛋白胨水溶液湿润滤膜, 调节集菌仪转速为160 r/min, 按薄膜过滤法全量过滤, 每膜用0.1%无菌蛋白胨水溶液300 ml分3次冲洗 , 在最后50 ml冲洗液中加入菌液1 ml［2］, 过滤至干 , 作为供试品管。

2.4 对照管的制备取过滤器, 加入50 ml 0.1%无菌蛋白胨水溶液, 加入相应的菌液1 ml, 滤干, 作为对照管。

2.5 无菌检查方法的验证分别取含大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和生孢梭菌的供试品管, 各加入硫乙醇酸盐流体培养基100 ml；含白色念珠菌和黑曲霉的供试品管, 各加入改良马丁培养基100 ml, 置相应培养温度培养。取对照管6管, 其中4管分别加入硫乙醇酸盐流体培养基100 ml, 再分别加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和生孢梭菌菌液各1 ml；另2管分别加入改良马丁培养基100 ml, 再分别加入白色念珠菌和黑曲霉菌液各1 ml,置相应培养温度培养。同时, 取上述菌液各1 ml, 按微生物限度检查法(平皿法)(中国药典2010版二部附录Ⅺ H)计数,每个菌株平行制备2个平皿, 生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基作液体计数, 测定所加菌数。结果见表1。