原核高效制备人乳头瘤病毒16型L1病毒样颗粒

解晓露，魏东，王国治，黄长江

宫颈癌是一种在全世界范围内死亡率仅次于乳腺癌的女性癌症，并且相对来说常见于年轻女性，是最常见的恶性肿瘤之一。在发展中国家妇女中，其发病率居第一位。70% 的宫颈癌是由高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）16 型和 18 型引起的，其中 16 型与宫颈癌关系最为密切[1]。此外，研究发现 HPV16 型也与人类其他癌症有关，如喉癌、食管癌、骨髓癌等[2]。最近的研究显示，HPV16 型是中国西南部最流行的高危血清感染型之一[3]。为了防治 HPV16 的感染从而有效控制相关肿瘤的发生，高效 HPV16 疫苗的研制日益成为研究热点。目前，世界上有两种 HPV VLPs 疫苗上市，均采用真核表达系统，分别是Merck 的表达于酿酒酵母表达系统的 Gardasil[4]和GSK 的源于昆虫细胞表达系统的 Cervarix[5]，这两种疫苗的制备工艺复杂，价格昂贵，在发展中国家难以普及，而发展中国家又是宫颈癌患病率和死亡率高发的国家，所以研制出价格低廉的宫颈癌疫苗迫在眉睫。本研究在大肠杆菌表达系统中，高效制备 HPV16L1 VLPs，用以制备经济的 HPV16 预防性疫苗。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器 限制型内切酶、T4 DNA连接酶、DNA 凝胶回收试剂盒、抽提质粒试剂盒均购自日本 Takara 公司；蛋白分子量标记购自美国 Thermo 公司；HPV16L1 单克隆抗体购自美国GeneTex 公司；羊抗鼠 IgG 购自中杉金桥公司。AKTA 层析系统和层析介质均为美国 GE 公司产品；透射电镜 H-7650 为日本日立公司产品。

1.1.2 载体和感受态细胞 PET30a 原核表达载体、PMD-18T 克隆载体和大肠杆菌（E.coil）DH5α、Rosetta(DE3)均为本室保存。

1.2 方法

1.2.1 重组非融合表达质粒 PET30a-HPV16L1的构建

1.2.1.2 HPV16L1 的扩增和表达质粒 PET30a-HPV16L1 的构建 以宫颈癌患者阴道分泌物中提取的 DNA 为模板，用所设计的引物进行 HPV16L1基因的 PCR 扩增，进行回收纯化，连接到PMD-18T 载体上，由北京擎科新业生物技术有限公司测序。正确无误后双酶切 PMD-18T- HPV16L1重组质粒和 PET30a 载体，在 T4 DNA 连接酶的作用下，16 ℃ 连接过夜，转化宿主菌 DH5α，挑阳性克隆提取质粒测序。

1.2.2 序列优化后的表达质粒 PET30a-HPV16L1的构建 在不改变氨基酸密码的前提下，按照大肠杆菌密码偏爱性对 1.2.1.2 扩增出的 HPV16L1 基因进行优化合成，基因两端分别加入 Nde I 和Hind III 酶切位点，基因优化和合成工作由Invitrogen 公司完成，得到 PMK-RQ-HPV16L1 重组质粒。

Nde I/Hind III 双酶切处理 PMK-RQ-HPV16L1重组质粒，从琼脂糖凝胶中切下目的条带，回收后获得 HPV16L1 基因片段，将其与经过同样处理的PET30a 载体连接，连接产物转化宿主菌 DH5α，在含卡那霉素的 LB 培养板上随机挑取菌落，培养后提取质粒进行 Nde I/Hind III 双酶切鉴定，并对阳性克隆测序。

1.2.3 HPV16L1 的表达 取序列优化前后的重组质粒 PET30a-HPV16L1 分别转化感受态Rosetta(DE3)，将 Rosetta(DE3) 转化菌接种到含有卡那霉素和氯霉素双抗性 LB 培养基中，于 37 ℃振荡培养过夜。次日，将培养物按 1∶100 的比例转接于 1 L 不含抗性的 LB 中，继续在 37 ℃ 摇床培养至 OD600值达到 0.6 时，加入 IPTG 至终浓度为 0.8 mmol/L，25 ℃ 诱导 8 h。离心收集菌体沉淀，用 1×PBS 洗涤菌体，称量菌体计算菌体湿重，按 20 ml 裂解液/g 湿重进行高压均质破碎处理，离心获得菌体裂解上清和沉淀。将上述表达过程中留取样品进行 SDS-PAGE 电泳，分析目的蛋白的表达情况。

1.2.4 HPV16L1 的纯化 菌体裂解上清过 0.45 μm孔径滤膜后作为样品，直接在蛋白纯化仪上进行Macrocap SP 阳离子交换层析纯化，含 500 mmol/L NaCl 的缓冲液洗脱杂蛋白，含 900 mmol/L NaCl的缓冲液洗脱目的蛋白。洗脱的目的蛋白用低盐缓冲液稀释一倍后，直接作为样品进行肝素-Sepharose FF 亲和层析，以含 500 mmol/L NaCl 的缓冲液洗脱目的蛋白。纯化过程中留取样品进行 SDS-PAGE电泳，分析蛋白纯化效果。

1.2.5 纯化产物的 Western blot 分析 将纯化蛋白 HPV16L1 进行 SDS-PAGE 电泳后电转移至硝酸纤维素膜上，用含 BSA 的封闭液封闭过夜，依次用 HPV16L1 单克隆抗体（1∶10000 稀释）及羊抗鼠 IgG-HRP（1∶20000）室温孵育 2 h，DAB 显色试剂盒显色并拍照。

1.2.6 HPV16L1 及其降解蛋白的液相-质谱鉴定 将纯化后的 HPV16L1 蛋白及其降解蛋白切胶送至中科院上海生命科学研究院蛋白质组研究分析中心进行液相-质谱鉴定。

1.2.7 透射电镜观察 VLPs 取少量纯化后的蛋白原液，铜网孵育 10 min，1% 磷钨酸（pH 7.0）负染 5 min，在 30000 倍下观察纯化产物。

2 结果

2.1 HPV16L1 扩增

将测序结果经 Blast 发现与 HPV16（序列号K02718）L1 基因序列相似度为 99%，与谷鸿喜等[6]在中国妇女宫颈癌组织中扩增出的 HPV16L1基因完全一致。

2.2 重组质粒的构建及鉴定

Nde I/Hind III 双酶切重组质粒 PET30a-HPV16L1 的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见两条带，一条约 1500 bp，为 16L1 基因，一条约 5000 bp，为 PET30a 载体（图 1），重组质粒经测序与理论序列完全一致，表明重组表达质粒构建正确。

图1 HPV16L1 重组质粒的酶切鉴定Figure1 Restrictive enzyme digestion analysis of HPV16L1 recombinant plasmid

2.3 HPV16L1 的诱导表达和蛋白形态的鉴定

表达产物经 SDS-PAGE 分析，序列优化后的Rosetta(DE3) 工程菌诱导后有一条特异性的蛋白条带：约 55 kD，大小与预期一致，而序列优化前的工程菌诱导后几乎没有目的蛋白的表达（图 2），表明序列优化使目的蛋白在原核系统中获得了高效表达。

图2 HPV16L1的诱导表达Figure2 Induction of HPV16L1 expression

高压均质破菌后发现上清中目的蛋白的表达量很高，实现了目的蛋白的高效可溶性表达（图3），使用 Quantity one v462 软件对目的蛋白可溶性表达量进行分析，结果显示目的蛋白约占总蛋白的 38%。

图3 HPV16L1 的可溶性表达情况Figure3 Soluble expression of HPV16L1 protein

2.4 HPV16L1 的纯化

纯化后的蛋白经 SDS-PAGE 分析有两条蛋白带，一条约 55 kD，为目的蛋白，一条约 45 kD，为降解蛋白（图 4）。

图4 纯化蛋白的 SDS-PAGE 分析Figure4 Analysis of purified protein by SDS-PAGE

2.5 HPV16L1 蛋白的 Western b1ot 分析

将纯化后的蛋白进行 Western blot 分析，在约55 kD 和 45 kD 处出现两条特异性条带（图 5），表明纯化后的蛋白是 HPV16L1 蛋白及其降解蛋白。

图5 Western blot 检测 HPV16L1 纯化产物Figure5 Detection of HPV16L1 purification by Western blot

2.6 HPV16L1 及其降解蛋白的液相-质谱鉴定

液相-质谱鉴定结果显示 2 个样品覆盖率分别为 56% 和 63%，均为 HPV16L1 蛋白，即分子量为 55 kD 左右的蛋白为目的蛋白，45 kD 左右的蛋白为降解蛋白。

2.7 HPV16L1 透射电镜观察

透射电镜观察纯化后的 HPV16L1 蛋白原液，视野中含有大量直径约为 50 nm 的球状颗粒，颗粒的大小和形态均与天然的病毒样颗粒一致（图6）。

图6 透射电镜下观察 HPV16L1 VLPs（× 30000）Figure6 Observation of HPV16L1 VLPs by transmission electron microscope (× 30000)

3 讨论

原核表达系统是一种成熟完善的基因克隆表达系统，其繁殖迅速，培养简单，操作方便，遗传稳定，成本低廉，生产率高，表达的外源蛋白对人无感染性，具有生物安全性高，特异性高等优点，同时有大量文献报道在大肠杆菌中表达的HPV16L1 蛋白可以在体外自我组装 VLPs[7]，因此，本研究选用原核表达系统来制备 VLPs。但是其表达时常出现可溶性表达量低、易形成包涵体等现象，这成为研究者面临的一大难题。国内外研究往往通过硫酸铵沉淀法来浓缩可溶性蛋白[8]，或者进行包涵体表达和纯化[7]，抑或是添加 GST 等助溶标签[9]。但是，硫酸铵沉淀法并不能从本质上解决问题，同时从工业生产的角度来说，生产率低，费时费力；包涵体表达量可观但纯化蛋白过程中必须经过变性和复性，复性率的高低和纯化后蛋白的活性都很难有保证；添加助溶标签虽可大大提高可溶性蛋白表达量，但后期很难将标签完全切除，残留的标签蛋白可能会对机体产生潜在危害。因此为了提高目的蛋白的可溶性表达，本研究进行了包括密码子偏好性、密码子使用频率、RNA 二级结构、GC 含量等一系列优化[10-11]，结果显示序列优化效果显著，大幅度提高了目的蛋白的可溶性表达，为高效制备 HPV16L1 VLPs 奠定了坚实的实验基础。

本研究在 HPV16L1 蛋白的纯化上与魏旻希等[8]有显著差别：首先，在纯化过程中没有加入任何变性剂和还原剂（如尿素、DTT 等），使目的蛋白维持其天然构象，采用直接纯化 HPV16L1 VLPs，省去了去除还原剂 DTT，诱导 HPV16L1 重新组装成 VLPs 的过程，结果显示纯化产物在电镜下观察为直径是 50 nm 左右的形态与天然病毒颗粒高度相似的 VLPs，说明在原核系统中，HPV16L1也可以自发形成 VLPs，这与 HPV16L1 在真核系统中自我组装成 VLPs 相一致，对后期进行大肠杆菌来源的 HPV VLPs 与已上市的来自真核系统的VLPs 疫苗的免疫原性比较的研究有重要意义。其次，在纯化步骤上进行适当简化，省去了硫酸铵沉淀法，两步层析方法纯化 HPV16L1 VLPs，第一步选用 Macrocap SP 填料，这是一种专门为大分子和大颗粒物质设计的阳离子交换填料，直接纯化了破菌上清液中 HPV16L1 VLPs，纯化效率较高；第二步选用的肝素亲和层析也是一种特异性纯化HPV16L1 VLPs 的方法[12]，经过两步纯化后，蛋白纯度大于 95%。总之，本研究简化了纯化步骤，直接纯化出了 HPV16L1 VLPs，更有利于工业化。

HPV16L1 蛋白纯化过程中，在 SDS-PAGE 电泳结果显示在分子量为 45 kD 左右有一条蛋白带，Western blot 结果显示，该蛋白与 HPV16L1 单克隆抗体有特异性免疫反应，同时液相-质谱鉴定该蛋白是 HPV16L1 的降解蛋白，这一结果与文献报道的在大肠杆菌中表达的 L1 蛋白极易降解的结果相一致[13-14]。L1 蛋白的磷酸化和糖化都很弱，且磷酸化半衰期很短，仅 60 min，120 min 后磷酸化基本消失[15]，这可能是蛋白降解的主要原因。提示我们在进行 HPV16L1 蛋白的纯化过程中，实验温度必须控制在较低温度下，而且尽量避免反复冻融，以及操作过程中加入某些蛋白酶抑制剂。

本实验在大肠杆菌中高效表达并纯化了HPV16 L1 蛋白，同时对纯化产物的稳定性进行了初步的研究，将纯化产物置于 4 ℃，通过进行SDS-PAGE 电泳来观察纯化产物的稳定性，结果在将近 1 个月的时间内仍维持 95% 以上，说明纯化产物的稳定性较高，具有重要的临床应用意义，对于纯化产物的长期稳定性，本实验室会继续进行深入研究，为进一步制备经济型宫颈癌预防性疫苗奠定实验基础。

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