位点特异整合型微环DNA的构建及应用

刘浏，周在威，马晴雯

链霉菌噬菌体 ΦC31 整合酶可介导链霉菌attB 位点与哺乳动物基因组假 attP 位点之间的重组，从而实现外源基因的位点特异性整合[1]。然而，整合会将载体中的细菌骨架带入基因组，造成安全隐患[2]。微环 DNA 是一种缺乏抗性标记基因和复制原点等细菌序列的小环超螺旋分子，有着较高的生物安全性和转基因表达效率[3]。除传统的阿拉伯糖诱导重组酶表达介导其识别位点重组获得微环DNA 的方法外[4-6]，LR 克隆酶[7-8]也被用于微环DNA 的制备[9]。但该方法同样需要在重组后将微环DNA 回收纯化，操作烦琐，得率也不甚理想。为避免上述问题，本文联合应用 LR 克隆酶和 ΦC31整合酶系统，建立了一种高效、快速获得位点特异整合型微环 DNA 的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与质粒 人宫颈癌细胞系 HeLa 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；质粒 pEGFP-N1-attB[10]和 pcDNA3.1(-)-P1A3-TPO[11]由本所构建保存；表达噬菌体 ΦC31 整合酶的质粒 pPGKPhiC31obpA[12]购于美国 Addgene公司（Plasmid No.13795）；大肠杆菌 E.coli TOP10感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 主要试剂 LR 克隆酶、DMEM 培养液、血清及 PBS 均购自美国 Life Technologies 公司，引物及 λattL 和 λattR 也由该公司合成；GenJet™Plus 转染试剂购自美国 SignaGen 公司；限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶购自美国 NEB 公司；SYBR®荧光定量 PCR 试剂购自日本 Takara 公司；hTPO ELISA 试剂盒购自美国 R & D 公司；PCR 纯化试剂盒和胶回收试剂盒购自德国 Qiagen公司。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的获得 将合成的 λattL 和 λattLrc单链（分别含有限制性内切酶 Afl III 和 Ase I 黏性末端，序列见表 1）干粉配制为 100 μmol/L 的溶液后等物质的量混合，置于 100 ℃ 沸水中待其自然冷却，即得到 λattL 双链。同样方法获得两端分别为 Spe I 和 Dra III 限制性酶切位点黏性末端的 λattR 双链。

以限制性内切酶 Pvu II 和 Spe I 分别酶切质粒 pPGKPhiC31obpA 和 pcDNA3.1(-)-P1A3-TPO，电泳切胶回收含有 ΦC31 整合酶表达盒和 hTPO基因的目的片段。

1.2.2 亲本质粒的构建 在 pEGFP-N1-attB 质粒（GFP 组对照质粒，简写为 pEGFP-C）的 Spe I和 Dra III 酶切位点之间插入 λattR 片段，在Afl III 和 Ase I 酶切位点之间插入 λattL 片段，获得质粒 pEGFP-N1-attB-λattR-λattL 后，在其 Afl III酶切位点处插入 ΦC31 整合酶表达盒，获得pEGFP-N1-attB-λattR-λattL-ΦC31Int 亲本质粒，简写为 pEGFP-PP。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

限制性内切酶 BamH I 和 Not I 双酶切亲本质粒 pEGFP-PP，去除 EGFP 后使载体自连。随后在该载体 Nhe I 酶切位点处插入 hTPO，获得目的基因为 hTPO 的亲本质粒 pTPO-attB-λattR-λattLΦC31Int，简写为 pTPO-PP。采用同样方法，将质粒 pEGFP-N1-attB-λattR-λattL 中的 EGFP 替换为hTPO，获得 pTPO-attB-λattR-λattL，作为 hTPO 组的对照质粒，简写为 pTPO-C。

1.2.3 LR 重组反应 在 LR 克隆酶作用下，亲本质粒 pEGFP-PP 和 pTPO-PP 发生重组反应，形成微环 DNA 和微质粒（图 1）。LR 重组反应体系为：亲本质粒 200 ng、10×TE 缓冲溶液 1 μl、LR克隆酶 2 μl、加 ddH2O 至 10 μl。反应条件：25 ℃，4 h。

1.2.4 转染 HeLa 细胞 将 HeLa 细胞消化传代至 12 孔板，于细胞汇合度为 80%～90% 时进行转染。参照转染试剂 GenJet™ Plus 说明书进行。主要步骤如下：移除培养液，以 PBS 冲洗细胞2 遍，加入 600 μl 无血清 DMEM 培养液。然后配制转染复合物：在 1.5 ml EP 管内加入 DNA 混合物，以无血清 DMEM 补足 50 μl，混匀。实验组 DNA 混合物为未纯化的 LR 重组体系 10 μl和 4 倍于微环 DNA 物质的量的 pPGKPhiC31obpA质粒。对照组 DNA 混合物为与微环 DNA 等物质的量的对照质粒和 5 倍于对照质粒物质的量的pPGKPhiC31obpA 质粒。因实验组 LR 重组产物中含有与微环 DNA 等物质的量的表达 ΦC31 整合酶的微质粒，故上述实验组及对照组 DNA 混合物中微环 DNA 及对照质粒的物质的量与 ΦC31整合酶质粒物质的量比值均为 1∶5。在另一 1.5 ml EP 管中按照 DNA（μg）∶转染试剂（μl）为 1∶3 的比例加入 GenJet™ Plus 转染试剂，以无血清DMEM 补足 50 μl，混匀。将上述转染试剂稀释液加入 DNA 混合物中，轻轻吹打混匀，室温静置20 min 后，将 100 μl 转染复合物逐滴加入 12 孔板中，轻轻摇匀。另设不转染质粒的空白对照组。转染 12 h 后，换新鲜的含血清 DMEM 培养液继续培养。

图1 LR重组反应示意图Figure1 Schematic diagram of LR recombination

1.2.5 LR 重组效率测定 以 EcoR I 酶切pEGFP-PP 的 LR 重组产物来鉴定重组反应的发生：若发生重组，则微环 DNA（pEGFP-MC）和微质粒分别被线性化，得到约 2.0 和 5.3 kb 两条带；若未发生重组，则亲本质粒被切成约 1.2 和6.1 kb 两条带。以 PvuⅡ 酶切验证 pTPO-PP 的LR 重组：若发生重组，则能切出约 2.7 kb（pTPOMC）和 5.3 kb（微质粒）两条带；若未发生重组，则能切出约 1.9 和 6.1 kb 两条带。可通过观察电泳图中各条带亮度粗略判断 LR 重组效率。

此外，应用荧光定量 PCR 方法检测各质粒的拷贝数可较为精确地计算 LR 重组效率。在亲本质粒 λattR 两端设计引物 MC-F 和 λattR-R（序列见表 1）扩增该质粒的特有片段，检测亲本质粒的拷贝数；同时，设计引物 MP-F 和 MP-R（序列见表 1）扩增 LR 重组反应前后拷贝数不变的片段，作为定量 PCR 内参。以 ddH2O 替代 LR 重组反应体系中的 LR 克隆酶作为 LR 重组反应前样品。将两组亲本质粒 pEGFP-PP 和 pTPO-PP LR重组反应前后样品分别稀释 100 倍和 1000 倍进行荧光定量 PCR，通过标准曲线法进行绝对定量，比较 LR 重组反应前后亲本质粒的拷贝数，获得LR 克隆酶的重组效率。计算公式如下：

另外，也可以通过鉴定转染细胞中整合载体是否为微环 DNA 来判断 LR 重组反应的效率。LR重组产物转染 2 周后，获取 27 个 GFP 阳性单克隆细胞基因组 DNA 用于 PCR 鉴定。在形成微环DNA 的 λattL 和 λattR 两端分别设计引物 MC-F和 MC-R（序列见表 1），若为微环 DNA 整合，则可扩增得到 119 bp 的条带。同时，以引物对EGFP-F 和 EGFP-R（序列见表 1）检测上述克隆中 EGFP 基因的整合（扩增产物长度为 585 bp）。重组效率计算公式如下：

1.2.6 转染率及整合率测定 pEGFP-MC 和pEGFP-C 转染 HeLa 细胞 24 h 后，分别接种 1 ×104个细胞至 3 个 10 cm 培养皿，剩余细胞应用流式细胞仪检测荧光细胞比例，作为瞬时转染率。接种于培养皿中的细胞不再传代，仅换液处理，待第 14 天后荧光镜检统计皿中 GFP 阳性细胞单克隆数，计算整合率。计算公式如下：

1.2.7 蛋白表达水平检测 pEGFP-MC 和pEGFP-C 转染 HeLa 细胞 14 d 后，挑取pEGFP-MC 转染组 23 个微环 DNA 整合 GFP阳性细胞单克隆和 pEGFP-C 转染组 8 个 GFP阳性细胞单克隆，将这些克隆化细胞经培养达到一定数量后，以流式细胞仪检测各细胞克隆的绿色荧光强度，评估 GFP 目的蛋白的表达水平。

pTPO-MC 和 pTPO-C 转染 HeLa 细胞 48 h后，收集各孔培养液，并接种 1×105个细胞至新的 12 孔板中，保持每孔 DMEM 培养液体积均为 1 ml；随后每 2.5 天收集一次培养液并将 1 ×105个细胞接种传代，直至转染后第 29.5 天。应用 hTPO ELISA 试剂盒检测各时间点收集的培养液中 hTPO 蛋白表达水平。操作步骤按照 ELISA试剂盒说明书进行。

1.3 统计学处理

以统计学软件 SPSS16.0 进行数据处理，各组转染率、整合率的测定及 GFP 和 hTPO 蛋白表达水平比较均采用方差分析，以 P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LR 重组效率鉴定结果

酶切鉴定电泳结果显示，重组体系中微环 DNA和微质粒的条带亮度明显高于亲本质粒（图 2A），直观地表明 LR 重组效率较高。

荧光定量 PCR 检测结果可见，由两组亲本质粒 pEGFP-PP 和 pTPO-PP 的两个稀释梯度得出LR 重组效率为 82.56% ± 0.76%（表 2）。

图2 LR 克隆酶重组效率鉴定Figure2 Identification of the LR recombination efficiency

表2 荧光定量 PCRa 检测 LR 重组效率Table2 LR recombination efficiency detected by real-time PCRa

GFP 阳性细胞克隆中 LR 重组片段 PCR 鉴定结果表明，随机挑选的 27 个 GFP 阳性细胞单克隆中有 23 个为微环 DNA 整合（图 2B、图2C），即 LR 克隆酶重组效率为 85.19%（23/27），与荧光定量 PCR 结果一致。

2.2 转染率的测定结果

流式细胞分析结果显示，微环 pEGFP-MC 的转染率显著高于传统质粒 pEGFP-C，为其 3.66 倍（24.80% ± 10.21% vs.6.77% ± 1.61%，P = 0.039，3 次独立实验，图 3A）。

2.3 整合率的测定结果

转染 2 周后，克隆计数并计算外源基因在细胞基因组中的整合率。结果显示，微环pEGFP-MC和传统质粒 pEGFP-C 的整合率分别为 0.82% ±0.11% 和 0.52% ± 0.07%（图 3B）。虽然微环 DNA的整合率仅为传统质粒的 1.58 倍，但两者相比有显著统计学差异（P = 0.014，3 次独立实验）。

2.4 蛋白表达水平的测定结果

图3 微环转染 HeLa 细胞转染率、整合率及目的蛋白表达水平（A：微环 DNA 及对照质粒转染 HeLa 细胞的转染率；B：微环 DNA 及对照质粒转染 HeLa 细胞的整合率；C：微环 DNA 及对照质粒转染 HeLa 细胞的 GFP 蛋白表达水平；D：微环 DNA 及对照质粒转染 HeLa 细胞的 hTPO 蛋白表达水平）Figure3 Transfection efficiency, integration rate, and protein expression level of genes in the minicircle DNA (A: Transfection efficiency of minicircle DNA; B: Integration rate of minicircle DNA; C: GFP expression level of minicircle DNA; D: hTPO expression level of minicircle DNA)

以流式细胞仪检测经 PCR 鉴定为微环 DNA整合的 23 个细胞克隆以及对照组 pEGFP-C 整合的 8 个细胞克隆的 GFP 荧光强度，分别为（958.60 ± 328.11）和（137.99 ± 83.46）（图 3C），前者为后者的 6.95 倍，有极显著统计学差异（P <0.001）。

此外，ELISA 检测 pTPO-MC 和 pTPO-C 在转染后不同时期 hTPO 的表达水平，结果如图 3D所示。转染 2、4.5、7、9.5 d 时，微环 pTPO-MC组 hTPO 蛋白表达水平均明显高于传统质粒组，前者为后者的 4～12 倍，有统计学差异（P < 0.05，3 次独立实验）。然而，pTPO-MC 转染组和 pTPO-C转染组分别在转染后第 14.5 天和第 12 天收集的培养液上清中即无法检测到目的蛋白 hTPO 的表达。

3 讨论

ΦC31 整合酶系统可介导含链霉菌 attB 位点及外源基因的质粒载体整合于哺乳动物基因组的假 attP 位点处。序列特征分析表明，假 attP 位点与野生型 attP 位点有一定的序列相似性，且多位于基因间或内含子区域[13]。因此，外源基因在假attP 位点处的整合使得靶细胞基因组被破坏的风险明显低于随机整合，安全性有所提高。此外，由于该系统介导的目的基因整合后具有较好的表达水平，因而在基因治疗领域得到了广泛的应用[14]。但上述整合会将质粒载体上的细菌骨架序列也带入基因组，仍然存在安全隐患[2]。

微环 DNA 是由传统质粒在大肠杆菌内通过位点特异性重组将其抗性标记基因、复制原点等细菌序列删除而得到的一种小环超螺旋分子，具有较高的转基因表达水平和安全性[3]。经典的微环DNA 制备方法是以阿拉伯糖诱导重组酶的表达，重组酶介导其识别位点发生重组，形成含细菌骨架的微质粒和含目的基因表达盒的微环 DNA，微环DNA 必须与微质粒分离才能得到进一步的应用[3]。近年来，微环 DNA 的制备方法得到了多种改进[9,15]。与传统采用阿拉伯糖诱导方法不同的是，Tasic 等[9]成功地利用 LR 克隆酶在体外反应中获得了微环 DNA。

然而，经典的阿拉伯糖诱导方法[16]和采用 LR克隆酶制备微环 DNA 时[9]，为将微环 DNA 与微质粒分离，需要酶切消化微质粒和残留亲本质粒、纯化回收微环 DNA 等操作，微环 DNA 的产率很低。虽然优化的阿拉伯糖诱导法的微环 DNA 产率有所提高[15]，但其需要特定的工程菌株。

为避免上述问题，本文联合应用 LR 克隆酶和ΦC31 整合酶系统，结合两个系统的优势，建立了一种获得位点特异整合型微环 DNA 的方法：借助LR 克隆酶将细菌骨架序列删除后，利用 ΦC31 整合酶系统实现目的基因的位点特异性整合。由于在利用 ΦC31 整合酶系统实现外源基因位点特异整合时，必须将含有 attB 位点和目的基因的质粒与表达 ΦC31 整合酶的质粒进行共转染[14]，因此本文在构建亲本质粒时在微质粒部分连入了 ΦC31整合酶表达盒，使该微质粒在后续的转染实验中可被有效利用，而无需与微环 DNA 分离。该亲本质粒经 LR 重组后获得的微环 DNA 与表达 ΦC31整合酶的微质粒的物质的量之比为 1∶1。我们的研究表明，在含 attB 位点质粒物质的量固定的情况下，共转染表达 ΦC31 整合酶质粒的物质的量越高，整合效率越高（两者比例在 1∶1～1∶50 的范围内，未发表数据）。因此，为保证实验中目的质粒有较高的整合效率，本文在将 LR 重组反应产物直接转染 HeLa 细胞的同时，额外加入 4 倍于微环 DNA 的表达 ΦC31 整合酶的质粒进行共转染，使含 attB 位点质粒与表达整合酶质粒的物质的量之比达到 1∶5（与对照组一致）。实验表明，LR 克隆酶可高效介导亲本质粒的 LR 重组，微环 DNA 的产率达到 80% 以上，产物中微环DNA 与残留亲本质粒的物质的量之比为（4.38 ±0.44），是优化的阿拉伯糖诱导方法[15]的近 3 倍（4.38/1.51，P < 0.001）。且该 LR 重组产物无需纯化，可直接转染 HeLa 细胞系，避免了回收过程中的损失，大大减少了实验操作步骤和时间。未来可尝试对 LR 重组反应程序进行优化，如 LR 克隆酶分批加入、增加 LR 克隆酶用量以及延长反应时间等，尽可能提高微环 DNA 的产率，减少残留亲本质粒的含量。

ELISA 及流式细胞分析结果显示，与传统质粒相比，微环 DNA 转染组的目的蛋白 GFP 和hTPO 均呈现明显的高表达状态，这可能与微环DNA 具有较高的转染率以及不含细菌骨架序列有关[17]。然而，微环 pTPO-MC 在转染后第 14.5 天收集的培养液上清中即无法检测到目的蛋白 hTPO的表达。这可能是由于微环 DNA 不含真核筛选基因，细胞在未加压传代生长过程中，整合外源基因的细胞逐渐被具有生长优势的未整合细胞淹没[18]，使得目的蛋白表达不断降低直至消失。相比之下，由于以 GFP 为目的基因的微环载体转染细胞在低密度培养过程中未进行传代处理，因此不存在上述与 hTPO 表达类似的现象，转染 14 d 后仍可观察到 GFP 表达。随后的 GFP 阳性细胞克隆化培养结果表明，克隆化操作是获得稳定整合并表达目的基因细胞克隆的有效途径。因此，未来可联合应用其他重组酶系统，如 Cre/loxP 系统以及 FLP/FRT系统，在构建亲本质粒时将两端有同向重组酶识别序列的真核筛选基因连接入微环 DNA 部分，药物筛选获得目的细胞后，诱导重组酶表达删除筛选基因，有望实现安全、高效、无标记的转基因。

总之，本文联合利用 LR 克隆酶和 ΦC31 整合酶建立了一种获得位点特异整合型微环DNA 的方法，为微环 DNA 作为转基因操作的理想载体奠定了良好的基础。

[1] Calos MP.The phiC31 integrase system for gene therapy.Curr Gene Ther, 2006, 6(6):633-645.

[2] Oliveira PH, Mairhofer J.Marker-free plasmids for biotechnological applications - implications and perspectives.Trends Biotechnol, 2013,31(9):539-547.

[3] Mayrhofer P, Schleef M, Jechlinger W.Use of minicircle plasmids for gene therapy.Methods Mol Biol, 2009, 542:87-104.

[4] Bigger BW, Tolmachov O, Collombet JM, et al.An araC-controlled bacterial cre expression system to produce DNA minicircle vectors for nuclear and mitochondrial gene therapy.J Biol Chem, 2001, 276(25):23018-23027.

[5] Chen ZY, He CY, Ehrhardt A, et al.Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo.Mol Ther, 2003, 8(3):495-500.

[6] Jechlinger W, Azimpour Tabrizi C, Lubitz W, et al.Minicircle DNA immobilized in bacterial ghosts: in vivo production of safe non-viral DNA delivery vehicles.J Mol Microbiol Biotechnol, 2004, 8(4):222-231.

[7] Landy A.Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.Annu Rev Biochem, 1989, 58:913-949.

[8] Hartley JL, Temple GF, Brasch MA.DNA cloning using in vitro site-specific recombination.Genome Res, 2000, 10(11):1788-1795.

[9] Tasic B, Hippenmeyer S, Wang C, et al.Site-specific integrasemediated transgenesis in mice via pronuclear injection.Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(19):7902-7907.

[10] Ma QW, Sheng HQ, Yan JB, et al.Identification of pseudo attP sites for phage phiC31 integrase in bovine genome.Biochem Biophys Res Commun, 2006, 345(3):984-988.

[11] Liu Y, Yan JB, Wang Q, et al.Construction and expression of tissue-specific vectors expressing human thrombopoietin gene in the mammary gland.J Med Mol Biol, 2007, 4(4):283-288.(in Chinese)刘茵, 严景斌, 王强, 等.人血小板生成素基因乳腺特异表达载体的构建和表达.医学分子生物学杂志, 2007, 4(4):283-288.

[12] Raymond CS, Soriano P.High-efficiency FLP and PhiC31 site-specific recombination in mammalian cells.PLoS One, 2007,2(1):e162.

[13] Chalberg TW, Portlock JL, Olivares EC, et al.Integration specificity of phage phiC31 integrase in the human genome.J Mol Biol, 2006,357(1):28-48.

[14] Karow M, Calos MP.The therapeutic potential of ΦC31 integrase as a gene therapy system.Expert Opin Biol Ther, 2011, 11(10):1287-1296.

[15] Kay MA, He CY, Chen ZY.A robust system for production of minicircle DNA vectors.Nat Biotechnol, 2010, 28(12):1287-1289.

[16] Chen ZY, He CY, Kay MA.Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo.Hum Gene Ther,2005, 16(1):126-131.

[17] Chen ZY, He CY, Meuse L, et al.Silencing of episomal transgene expression by plasmid bacterial DNA elements in vivo.Gene Ther,2004, 11(10):856-864.

[18] Roberts PE, Mather JP.Introduction to cell and tissue culture.New York: Plenum Press, 1998:77-78.