PCR-DGGE 法在水体微生物多样性研究中的应用

焦晨JIAO Chen；夏甜XIA Tian

（①内蒙古化工职业学院材料工程系，呼和浩特 010070；②内蒙古化工职业学院思政理论教研部，呼和浩特 010070）

（①Department of Materials Engineering，Inner Mongolia Vocational College of Chemical Engineering，Hohhot 010070，China；②Ideological and Political Theory Teaching and Research Department，Inner Mongolia Vocational College of Chemical Engineering，Hohhot 010070，China）

1 湖泊水体系微生物生态学

1.1 湖泊水体系微生物多样性 ①藻类，常见的藻类约56 个属138 个种，包括：硅藻、裸藻、金藻、甲藻、小球藻属，栅列藻属，以及蓝细菌等。②细菌，在被研究水体中BOD 符合负荷值比较低、维持好氧状态的富营养话水体中，常见的优势菌群有芽孢杆菌属、假单胞菌属、产甲烷菌属、光和细菌属、硫酸盐还原菌等。③原生动物及微型后生动物，富营养化水体中常见固着型纤毛虫、鞭虫、甲壳类、摇蚊幼虫等。

1.2 湖泊水体系微生物间的相互关系 位于食物链中的各种生物与其生存环境间通过一系列的能量和物质的转移与循环保持着相互依存的稳定关系，即生态平衡。但当湖泊水体系中大量累积N、P 等营养元素时，生态系统的平衡就被破坏，主要表现为藻类通过大量繁殖，数量明显增多，进而导致水体透明度下降和臭阈值增加。经过反复试验验证，向湖泊水体系中投加复合细菌能与原有水体中微生物形成共生增殖关系，从而使藻类优势种群无法形成，起到了强化水体生物自净能力，恢复湖泊生态平衡的作用。

2 微生物多样性分析的常用方法

2.1 水体微生物多样性的传统研究方法 水体微生物多样性的传统研究方法是先将被检测水体样品中的微生物进行分离培养，经过纯培养后获得纯菌株，再研究纯菌株的特征及细胞性质，最后总结特性。但由于微生物形态简单，个体较小，仅依靠外观形态观察无法获得太多信息，且自然界中大多数微生物无法依靠纯培养分离，也不能精确鉴定分离物，进而揭示分离物间的系统发育关系。

2.2 分子生物学技术 应用分子生物学技术研究水体微生物生态学，能够在一定程度上避免微生物多样性丢失及种群构成变化等问题的发生，有利于被研究水体微生物中新的菌株、新菌种的发现，进一步提高对环境微生物多样性的认知水平。

3 应用PCR-DGGE 技术进行水体微生物多样性检测的原理、步骤和主要优缺点

3.1 应用PCR-DGGE 技术进行水体微生物多样性检测的原理 本论文拟采用基于凝胶中不同DNA 片段电泳迁移率差异的变性梯度凝胶电泳DGGE 技术分离被研究水体系微生物的DNA。

如图1 将尿素和甲酰胺等DNA 变性剂添加到聚丙烯酰胺凝胶中，使溶液呈现线性的变性剂浓度梯度变化。在电泳过程中水体微生物的DNA 双链分子在变性凝胶中逐步进行解链，形成解链区域，此接连区域的形成增大了DNA 分子的迁移阻力。当到达一定变性剂浓度，水体微生物的DNA 分子在变性凝胶中的解链程度恰好合适，DNA分子所受到的迁移阻力与周围电场力互相平衡时，DNA分子便停留在该变性浓度的聚丙烯酰胺凝胶中。DNA 双链分子由于碱基排列顺序不一样解链区域及解链行为也不相同，导致虽然处于同种变性凝胶电泳环境中，其迁移行为也不一致，因此可以在其周围电场作用下得到分离。

为了提高被研究水体样品中微生物多样性的检验精确度和检出率，能够更好的反映被检测水体微生物的实际情况，彻底分离DNA 片段，在PCR 扩增过程时将GC 发夹结构添加到正向引物的5'端，使其在PCR 过程中，通过扩增连接到目的DNA 双链分子片段的一端上[1]，使其在含有变性剂的电泳凝胶中难以完全解链而形成DNA 单链。由于单链DNA 在DGGE 凝胶中的电泳行为完全取决于DNA 的分子大小，而与DNA 的碱基排列顺序无关，因此DGGE 电泳无法将其完全分离。因此，可以说只要将检测过程中的电泳条件设置合适且其满足条件足够细致，哪怕仅有一个碱基区别的DNA 片段也可以被区分。

应用PCR-DGGE 技术在水体微生物多样性研究中具有以下优点：检测极限低；检测速度快；检测费用低；结果有较强的客观性；能够针对多个样品及多种微生物进行同时检测；可以结合其他检测方法提高检测质量。

3.2 PCR-DGGE 技术分析微生物多样性的主要实施步骤：①环境样品微生物DNA 的提取；②环境样品微生物DNA 的纯化；③Touch-down PCR[2]；④GC 发夹；⑤染色和测序。

3.3 PCR-DGGE 技术分析研究水体系微生物多样性的局限性 如同任何检测分析技术一样，PCR-DGGE 技术分析微生物多样性也存在一定的局限性，其局限性主要表现在如下几个方面：①存在DNA 片段检测的最理想长度一般在200～500bp 之间，所以能够提供的生物系统发育信息具有局限性[3]。②在湖泊水体系微生物多样性检测中，由于被研究水体样品中个别种类的微生物16S rDNA 在复制时的异质性问题及异源核酸双链分子的检出影响，会导致检测结果偏离真实值略高。③DNA 片段扩增后的PCR产物由于受到具有不同序列的DNA 共迁移问题的影响，DGGE 电泳图谱中可能出现同一条带中含有不同种类的微生物，这将导致对湖泊水体环境微生物的多样性估计偏低。同时受到电泳条件的影响，也不能保证具有序列差异的DNA 片段完全分离。④无法还原被研究水体中微生物在生活环境中的真实图景，也无法提供微生物数量、群落新陈代谢活性和基因水平等研究信息，需要进一步结合微电极测量或荧光原位杂交等其他技术方法对被研究水体系中的微生物进行更详尽地群落的复杂性分析。⑤DGGE凝胶电泳技术虽然可以检测到占有超过全部研究水体系的整个群落微生物数量1%的优势菌群的存在，但仍无法将被研究水体样品中环境微生物群落的复杂性完整地体现出来。对于以上技术方法中存在的检测缺陷，可以从改善PCR 扩增及DGGE 电泳条件着手；同时将与其他传统的技术检测方法与DGGE 电泳技术进行有机的结合、相互补充，这样将被研究水体系微生物群落的代谢、数量、结构和功能等情况的动态变化更贴近实际地反映出来，并进一步将原位生理等环境中微生物的多样性信息进行表达，从而不断提高分析微生物生态学的研究水平。

4 总结

本文拟使用PCR-DGGE 分子生物技术分析研究水体微生物群落多样性，使用该方法的研究较少目前仍然没有明确出一种具体的、行之有效的方法来对微生物群落多样性研究进行实验，实验的后续性研究拟从传统培养方法上对各种菌体进行更全面的研究，进而将分子生物技术在水体微生物群落多样性上建立起一套快捷、可靠的分析方法，在对水体微生物处理以及富营养化水体的治理研究中起到相应的作用。

[1]曾薇,杨庆,张树军等.采用FISH、DGGE 和Cloning 对短程脱氮系统中硝化菌群的比较分析[J].环境科学学报,2006,26(5).

[2]刑德峰,任南琪,宋业颖等.DG-DGGE 分析产氢发酵系统微生物群落动态及种群多样性[J].生态学报,2005,25(7).

[3]陈桐生,李建军,岑英华等.DG-DGGE 分析除臭生物滤池微生物多样性及富集后的种群结构差异[J].应用与环境生物学报,2006,12(1).