人乳头瘤病毒的环介导等温扩增检测法

罗永富

(湖南中医药高等专科学校 基础医学部， 湖南 株洲 412012)

人乳头瘤病毒的环介导等温扩增检测法

罗永富*

(湖南中医药高等专科学校 基础医学部， 湖南 株洲 412012)

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是引起尖锐湿疣甚至癌变的病原体。PCR技术检测病毒DNA序列具有特异、敏感等特点，但对仪器设备及检测人员技术要求较高，不适合于基层医疗单位临床实验室的常规诊断方法。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术针对靶基因6个区域设计4条特异引物，利用链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在恒温条件下完成扩增，扩增效果可用凝胶电泳、比浊、染色等多种方法检测，具有反应时间短、肉眼可判断结果和不需要PCR仪等优点。国内外利用LAMP技术检测HPV的方法研究偶有报道[1-2]，但针对HPV-6和HPV-11成功的方法研究未见文献报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本来源：10例标本均取自邵阳医专附属医院基因诊断室。在告知患者并征得同意的情况下由门诊医生用棉拭子在患者外阴部疑似病灶部位涂抹，置于装有1 mL无菌0.9%氯化钠注射液的试管中送检。其中6例经荧光PCR验证为HPV病毒阳性临床标本；2例沙眼衣原体阳性标本和2例解脲支原体阳性标本作为LAMP检测HPV病毒的阴性对照。

1.1.2 试剂：限制性内切酶(Promega公司)；Betaine(Fluka公司)；Bst DNA Polymerase(Biolabs 公司)；100 bp DNA Ladder(BioDev公司)；DNA Maker Ⅰ(天根公司)；dNTP 和Taq plus DNA聚合酶(北京鼎国公司)；病毒DNA提取试剂盒(四川天泽公司)；MgSO4(Sigma公司)；SYBR Green Ⅰ(北京天恩泽基因科技有限公司)；其余试剂为国产分析纯。

1.1.3 引物：选取HPV-6E6基因(基因序号：AF092932)的174～381 bp序列和HPV-11E6基因(基因序号：M14119)的129～306 bp区域序列，用专用引物软件(Primer Explorer V4)分别设计HPV-6与HPV-11正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向内引物(FIP)和反向内引物(BIP)4条，引物由广州英骏公司合成。用BLAST软件进行互补分析，HPV-6的4条引物不与HPV-11E6 DNA序列互补；HPV-11的4条引物不与HPV-6E6 DNA序列互补。

1.2 方法

1.2.1 样本处理与DNA提取液的制备:将10例送检标本充分振荡悬浮，挤干棉拭子中的水分，弃棉拭子，15 000 r/ min离心5 min，弃上清液，留沉淀，加600 μL病毒DNA提取液充分混匀，加700 μL异丙醇，振荡混匀，12 000 r/ min离心1 min，弃上清液，沉淀用75%乙醇洗涤2次，12 000 r/min离心1 min，弃上清液，将离心管倒置于滤纸上10～15 min，待酒精挥发干净后加入100 μL TE溶液4 ℃过夜充分溶解DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.2 环介导等温扩增(LAMP):取两组反应杯，每组10只，标以①～⑩的标号，其中①～⑥为PCR确定的临床HPV阳性标本，⑦～⑩为4例阴性对照标本。每只反应杯对应加入DNA提取液2.0 μL，第一组加入HPV-6的4条引物，第二组加入HPV-11的4条引物，加入其他试剂。置于65 ℃孵育60 min。然后置于80 ℃ 2 min灭活酶，终止扩增。

1.2.3 电泳与结果判断:取1 μL扩增液与0.2 μL上样缓冲液混匀，点样于含0.8 μg/mL溴化乙锭的2%～3 %琼脂糖凝胶中，70 V电泳约60～100 min后置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状区带，则判为阳性结果；如无任何区带则结果为阴性。

1.2.4 酶切鉴定:取经电泳确定HPV-6阳性的扩增液和HPV-11阳性扩增液分别进行酶切分析，以位于HPV-6E6基因251～254 bp区域的AluI和位于HPV-11E6基因156～159 bp区域的TaiI作为酶切位点进行酶切反应。而后取2.5 μL酶切液进行琼脂糖凝胶电泳。

1.2.5 染色反应与结果判断:向每只反应杯里剩余的扩增液中加入荧光染料SYBR Green Ⅰ 1.0 μL，混匀，置紫外灯下观察结果。反应混合物变绿为阳性；保持 SYBR Green Ⅰ的橙色不变为阴性。

1.2.6 LAMP敏感性分析:260 nm测定HPV DNA提取液的DNA浓度，调整浓度为1.0×104mg/L，10倍系列稀释为10×10-1～10×10-6mg/L 6个浓度，分别用LAMP和PCR检测。

2 结果

2.1 电泳结果:用HPV-6LAMP引物检测6例HPV-6/HPV-11阳性临床标本，临床标本①，②，③，④和⑤出现LAMP梯状区带(图1)；用HPV-11 LAMP引物检测6例PV-6/HPV-11阳性临床标本①，②，⑤和⑥出现LAMP梯状区带(图2)。4例阴性对照标本均未见任何区带。

1.100 bp DNA marker; 2～7.HPV-6/11 positive samples ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥; 8.negative control图1 HPV-6 LAMP引物扩增HPV6/11电泳图Fig 1 The specificity of HPV-6 LAMP primer-amplified HPV-6/11 electrophoretogram

1.100b p DNA marker; 2～7.HPV-6/11 positive samples ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥; 8.negative control图2 HPV-11 LAMP引物扩增HPV6/11电泳图Fig 2 The specificity of HPV-11 LAMP primer-amplified HPV-6/11 electrophoretogram

2.2 酶切结果:取HPV-6 LAMP液④和HPV-11 LAMP液⑥分别进行酶切分析，AluI酶切片段有：139、70、118和11 bp。TaiI酶切片段有：196、160、144和25 bp。

2.3 染色结果:6例HPV阳性标本扩增液均显绿色，为阳性。4个对照标本扩增液均无颜色变化，为阴性。

2.4 LAMP敏感性分析结果:LAMP和PCR检测HPV-6、HPV-11的敏感性均为10×10-6mg/L。

3 讨论

尖锐湿疣在欧美国家已居性传播疾病的首位，在我国居第2位，成为人们关注的社会公共问题之一。因此，HPV DNA的检测对流行病学的调查和公共健康问题具有重要的价值。目前HPV的检测几乎依赖于分子生物学方法检测其基因, PCR法比较费时且需要特殊的仪器，因此在临床推广应用上受到限制[3]。本研究收集了6例经荧光PCR鉴定过的HPV阳性临床标本，检测发现该6例HPV阳性标本中检测出标本③和④仅HPV-6阳性，标本⑥仅HPV-11阳性，此外，标本①，②和⑤为HPV-6和HPV-11双阳性。表明此3例存在HPV-6和HPV-11两型病毒同时感染。取HPV-6 LAMP产物④和HPV-11 LAMP产物⑥分别进行酶切鉴定，酶切电泳结果与理论预计相符。染色反应显示6例HPV阳性标本均为阳性，4例对照标本均为阴性。敏感性实验结果显示LAMP检测HPV-6和HPV-11DNA的最低浓度可达10×10-6mg/L水平，其敏感性与PCR相当。以上结果显示该法不仅可区别HPV型别，而且具有较高的特异性与敏感性，可作为HPV的快速检测方法推广应用。

[1] Chitladda S, Temduang L, Patcharee J,etal. Rapid detection of the most common high-risk human papillomaviruses by loop-mediated isothermal amplification [J]. J Viro Methods, 2011, 178: 22-30.

[2] Luo L, Nie K, Yang MJ.etal. Visual detection of high-risk human papillomavirus genotypes 16, 18, 45, 52, and 58 by loop-mediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye [J]. J Clin Microbiol, 2011, 49: 3545-3550.

[3] Kawai Y, Miyashita N, Kishi F,etal. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for the rapid detection of Chlamydophila pneumoniae [J]. J Clin Microbiol Infect Dis, 2009, 79: 605-615.

2013-02-06

2013-05-02

2011年度湖南省普通高校科学研究课题(11C0975)

*通信作者(correspondingauthor)： lyf155@263.net

1001-6325(2014)01-0113-02

Q 939.4

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