食欲素A促人胃癌SGC7901细胞凋亡

高之峰，张建福，费素娟，汪诗卉，董秋菊，韩红霞

(徐州医学院 1.附属医院 消化内科；2.生理学教研室， 江苏 徐州 221002)

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研究论文

食欲素A促人胃癌SGC7901细胞凋亡

高之峰1#，张建福2#，费素娟1*，汪诗卉1，董秋菊1，韩红霞1

(徐州医学院 1.附属医院 消化内科；2.生理学教研室， 江苏 徐州 221002)

目的观察食欲素A对胃癌SGC7901细胞生长的影响，并初步探讨其机制。方法常规培养胃癌SGC7901细胞，单独食欲素A处理及食欲素A受体拮抗剂SB408124干预后再用食欲素A作用，MTT法检测药物对SGC7901细胞抑制率；Hoechst33258荧光染色法及流式细胞术检测细胞凋亡；Western blot方法检测BCL-2、BAX、Cyt c和活化caspase-3蛋白的表达。结果食欲素A呈剂量-时间依赖性的抑制胃癌SGC7901细胞增殖，其中1.0 μmol/L 食欲素A作用24h对胃癌细胞增殖的抑制作用最强，抑制率为65.32%±2.51%(Plt;0.01)；食欲素A组可见较多凋亡细胞：胞核或胞质内可见浓染致密的蓝色荧光，有明显的核固缩，SB408124干预后，凋亡细胞数量明显减少(Plt;0.05)；食欲素A作用后，凋亡率为59.52%±1.38%，而SB408124干预后，凋亡率降至38.96%±1.82%(Plt;0.05)；食欲素A可上调凋亡相关蛋白BAX、Cyt c及活化caspase-3的表达，下调抗凋亡蛋白BCL-2的表达(Plt;0.05)，SB408124干预后，食欲素A作用减弱。结论食欲素A对胃癌SGC7901细胞生长具有明显的抑制增殖和促凋亡作用；食欲素A的作用是通过其选择性受体实现的。

食欲素A；SGC7901细胞；SB408124；凋亡

食欲素(orexin)是下丘脑区发现的一类神经肽[1]，包括食欲素A(orexin A, OA)和食欲素B(orexin B)。Orexin的基本功能是调节食欲、睡眠-觉醒周期、能量平衡、心血管和内分泌等[2]。近年来，国外有文献报道，orexin对离体培养的结肠癌细胞、神经母细胞瘤细胞等有促凋亡作用。

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，晚期治疗主要为化疗为主的综合治疗，而化疗药物的诸多不良反应限制了治疗效果，因此选择在化疗过程中对肿瘤细胞最大限度的杀伤，而对正常细胞毒性最低的药物越来越引起重视。是否orexin对胃癌细胞同样有杀伤作用从而用于胃癌的治疗，降低化疗的不良反应，目前国内尚无此方面研究报道，本实验以orexin A为研究对象，观察其对胃癌SGC7901细胞生长的影响，并初步探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

胃癌SGC7901细胞系(北京肿瘤研究所)；orexin A、orexin-1受体选择性拮抗剂(SB408124，SB)和Hoechst33258(Sigma公司)；Avnnexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物发展有限公司)；鼠抗BCL-2单克隆抗体、鼠抗BAX单克隆抗体、碱磷酶标记马抗小鼠IgG抗体、碱磷酶标记马抗小鼠β-actin和小鼠抗β-actin单克隆抗体(北京中杉生物技术有限公司)；细胞色素c小鼠单克隆抗体、碱磷酶标记的羊抗兔抗体和抗caspase-3 (激活型)兔单克隆抗体(碧云天生物技术研究所)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Amresco公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：SGC7901细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2和相对湿度95%的恒温培养箱中培养，2～3 d换液，每3～4天传代1次，实验时选用对数增殖期细胞。实验分为正常对照组(N组，即正常培养的胃癌细胞)、溶剂对照组(0.3% 二甲亚砜-DMSO)、orexin A组(0.01、0.1和1.0 μmol/L)、SB408124+ orexin A组(10 μmol/L SB408124预处理，1 h后加1.0 μmol/L orexin A)。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率：取SGC7901细胞5×104/mL接种于96孔板培养，待细胞贴壁后，按实验分组，分别培养6、12和24 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL。4 h后，吸尽各孔培养液，每孔加DMSO 200 μL，轻轻震荡10 min后，用酶标仪检测490 nm处各孔吸光度A值，计算细胞抑制率。细胞抑制率(%)=(1-实验组各孔平均A值/正常对照组各孔平均A值)×100%，实验重复3次。

1.2.3 Hoechst33258荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化：细胞接种于6孔板，常规培养。按分组实验后，吸尽培养液，加入0.5 mL 40g /L的多聚甲醛液固定细胞10 min；去固定液，用0.01 mol/L的PBS洗2次，洗涤时用手轻轻晃动，吸尽液体；加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，37 ℃染色15 min；去染色液，用PBS洗2次；荧光显微镜下观察，激发波长为350 nm，发射波长为460 nm，细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染为凋亡阳性细胞，计数并拍照保存。

1.2.3 流式细胞技术检测细胞凋亡率：取对数增殖期细胞以每孔1×105个/mL的细胞浓度接种于6孔板，每孔2 mL，于37 ℃、5% CO2培养箱内培养过夜，待细胞贴壁后，按实验分组药物作用24 h后，收集细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后离心，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用PBS洗涤2次后，将细胞重悬于500 μL结合缓冲液中，加入20 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(PI)中，轻轻混匀，室温避光5 min，用流式细胞仪检测。

1.2.4 Western blot法检测凋亡蛋白 BAX、BCL-2、Cyt c和活化caspase-3的表达：收集不同处理组的SGC7901细胞，加入蛋白裂解液，提取蛋白，进行蛋白定量，取蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，半干转至硝酸纤维膜上，加入BCL-2、BAX、Cyt c和caspase-3抗体，4 ℃冰箱过夜孵育后洗涤，加入二抗，室温孵育2 h，用缓冲液洗涤(配制：Tris 1.21 g,NaCl 5.84 g，Tween-20 1 mL，加双蒸水定容至1 000 mL，调pH至7.5)，洗涤后BCIP/NBT法显色，检测细胞中相关蛋白的表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度orexin A对SGC7901细胞增殖的抑制作用

3种剂量的orexin A分别处理6、12和24 h后，SGC7901细胞呈现出时间-浓度依赖性增殖抑制；其中1.0 μmol/L orexin A作用24 h对SGC7901细胞抑制作用最强(Plt;0.01)，故在以后的实验中orexin A均采用1.0 μmol/L作用24 h(图1)。

（29）妙用之因，神明之契，必有奧旨，願釋鄙懹。（《太上說玄天大聖真武本傳神呪妙經註》卷三，《中华道藏》30/554）

*Plt;0.01 compared with DMSO group图1 不同浓度orexin A分别作用6、12和24 h对SGC7901细胞的抑制作用Fig 1 Inhibitory effect of orexin A with different con- centrations in different times on viability of

2.2 Orexin A及SB408124对SGC7901细胞抑制率的影响

Orexin A处理后，细胞抑制率显著提高，经SB408124干预，细胞抑制率回降(Plt;0.01)，但仍高于对照组(Plt;0.05)(图2)。

2.3 荧光染色观察orexin A及SB408124对胃癌细胞形态及凋亡率的变化

镜下orexin A组可见较为典型的凋亡形态学变化：胞核皱缩，荧光强度增强，凋亡小体形成等，凋亡细胞增多；而SB408124干预后，同样可见典型的凋亡细胞及形态学变化但凋亡细胞数量减少(Plt;0.05)(图3)。

*Plt;0.05 compared with DMSO group； #Plt;0.05 compared with orexin A group and DMSO group图2 单独orexin A及SB408124干预分别作用对SGC7901细胞的抑制作用Fig 2 Inhibitory effect of orexin A and pretreatment with SB408124 on viability of SGC7901 cell

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

Orexin A组，细胞凋亡率明显增高(Plt;0.05)，经SB408124干预，凋亡率回降，仍高于对照组(Plt;0.05)(图4)

2.5 Orexin A及SB408124对胃癌SGC7901细胞蛋白BCL-2、BAX、活化caspase-3表达的影响

Orexin A处理后，BAX、Cyt c和活化caspase-3蛋白表达上调，BCL-2蛋白表达显著减少(Plt;0.05)。SB408124干预后，BAX、Cyt c和活化caspase-3蛋白表达下调，BCL-2蛋白表达增加(Plt;0.05)(图5)。

3 讨论

国外文献报道食欲素对结肠癌细胞、神经母细胞瘤细胞等有抑增殖促凋亡作用[3]。本实验结果显示，orexin A能呈剂量-时间依赖性的抑制SGC7901细胞的增殖，orexin A作用于SGC7901后凋亡率明显增高。表明orexin A对胃癌SGC7901细胞同样具有抑增殖促凋亡作用。

细胞对死亡信号的敏感性取决于胞内BCL-2/BAX竞争性的二聚体化过程，随BCL-2蛋白表达量的下降，有利于BAX二聚体形成，细胞发生凋亡[4-6]。

*Plt;0.05 compared with DMSO group； #Plt;0.05 compared with orexin A group图3 单独orexin A及SB408124干预分别作用24 h对SGC7901细胞凋亡的影响Fig 3 Effect of orexin A and pretreatment with SB408124 on cell apoptosis in SGC7901 cell (±s,%, n=5)

A.N; B.DMSO; C.OA; D.SB+OA;*Plt;0.05 compared with control group； #Plt;0.05 compared with orexin A group图4 单独orexin A及SB408124干预分别作用对SGC7901细胞凋亡率的影响Fig 4 Effect of orexin A and pretreatment with SB408124 on cell apoptosis in SGC7901 cell(±s, %, n=3)

Orexin有orexin-1受体(OX1R)和orexin-2受体(OX2R)二种亚型，SB408124是OX1R的选择性拮抗剂[9-10]，orexin A作用于结肠癌细胞HT29-D4膜上的OX1R，诱导Cyt c释放，激活线粒体/细胞色素c介导的细胞凋亡，从而引发了orexin 对结肠癌细胞的促凋亡作用[11]。 本实验采用了单独orexinA作用及SB408124干预后再用orexin A作用对比来观察两种处理方法对细胞的影响。结果显示：与单独orexin A作用比较，SB408124干预后，细胞抑制率、凋亡率均明显下降；Cyt c及活化caspase-3蛋白的表达量也较单独orexin A组下降。上述实验结果提示本实验中orexin A对胃癌细胞的作用是通过OX1R实现的。

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with orexin A group图5 单独orexin A及SB408124干预分别作用对SGC7901细胞BCL-2、BAX、Cyt c及活化caspase-3蛋白表达的影响

综上所述，本实验研究显示orexin A对胃癌SGC7901细胞有明显的抑制增殖和促凋亡的作用，而orexin A诱导胃癌细胞凋亡的作用是通过其选择性受体实现的，尽管具体的分子机制有待进一步研究探索，但此研究结果也进一步补充了orexin 的生物学功能，这也为肿瘤的预防、治疗起到一定的指导作用。

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Orexin A promotes the apoptosis of human gastric cancer cell SGC7901

GAO Zhi-feng1#, ZHANG Jian-fu2#, FEI Su-juan1*, WANG Shi-hui1, DONG Qiu-ju1, HAN Hong-xia1

(1.Dept of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College;2.Dept. of Physiology, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China)

ObjectiveTo explore the effect of orexin A on the growth of human gastric cancer cell line SGC7901 and its mechanisms.MethodsThe SGC7901 cells were treated by orexin A and SB408124 (an antagonist of orexin A receptor subtype 1). The MTT assay was used to detect growth inhibitory rates of orexin A on human gastric cell SGC7901. The apoptosis was determined by Hoechst 33258 fluorochrome staining and flow cytometric analysis; and we used Western blot to detect the expressions of BCL-2 BAX Cyt c and caspase-3.ResultsOrexin A can inhibit the growth of SGC7901 cells. This can be proved by a direct relationship between a longer time for cells to culture when given a higher dose of orexin A. The strongest inhibitory rate was 65.32%±2.51%, when we used 1.0 μmol/L orexin A treat for 24 h(Plt;0.01); we can see many apoptotic cells that the nuclear condensation in orexin A group，While cells that were pretreated with SB408124 showed the number of the native cell was decreased (Plt;0.05). After treated with orexin A, the apoptosis rate was 59.52%±1.38%， but when we pretreated with SB408124, the apoptosis rate decrease to 38.96%±1.82%；the expressions of BAX Cyt c and caspase-3 protein were increased, but the expression of BCL-2 was decreased(Plt;0.05). As mentioned above, the inhibitory effects of orexin A on SGC7901 cell were weakened by the pretreatment with SB408124.ConclusionsOrexin A significantly inhibits the growth of SGC7901 cells through inducing cell apoptosis. Its molecular mechanism is associated with OX1R.

orexin A; SGC7901 cell; SB408124; apoptosis

2013-04-07

2013-06-24

*通信作者(correspondingauthor)： xhbyjs@xzmc.edu.cn

1001-6325(2014)01-0098-06

R 735.2

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