不同光照强度下氮素对烤烟质体色素降解产物及品质的影响

云菲，刘国顺，宋晶

河南农业大学烟草学院/国家烟草栽培生理生化研究基地，郑州 450002

不同光照强度下氮素对烤烟质体色素降解产物及品质的影响

云菲，刘国顺，宋晶

河南农业大学烟草学院/国家烟草栽培生理生化研究基地，郑州 450002

以烤烟品种豫烟5号为材料，采用4种光照强度和3种氮素水平的复因子盆栽试验，分析了不同光照强度下氮水平对烤烟质体色素降解产物、有机酸及碳氮代谢产物的调控效应。结果表明：随光照强度降低和氮素水平升高，质体色素(chla、chlb、chla+b、car)和新植二烯含量升高，两者存在显著正相关性；类胡萝卜素降解产物含量在适度弱光(L2)下最高，自然光强下中、低氮处理有利于其形成和积累，弱光条件下高氮处理含量较高；随光强减弱，多元羧酸总量升高，不饱和脂肪酸总量降低；遮阴条件下增施氮肥促使有机酸含量增加，饱和脂肪酸含量在高氮水平下最高；随施氮量增加及光强减弱含氮化合物含量上升，碳水化合物含量下降，烟株氮代谢强于碳代谢。叶绿素降解产物与碳水化合物间存在显著正相关性，类胡萝卜素降解产物与含氮化合物间存在显著正相关关系。弱光下控制氮素用量调控质体色素含量是提高烟叶品质和香气质量的有效途径。

光照强度；氮素；烤烟；质体色素；品质

光照强度对烟株光合作用及碳氮代谢平衡起着关键作用[1-3]。氮素营养水平对烟叶品质形成至关重要，施氮可增加香气物质的含量，提高香气质量[4-6]。在烟株生长过程中，光照、氮素只有维持平衡、协调供应，才能发挥其最佳的互作效应[2]。当烟叶香味品质提高时，类胡萝卜素降解产物明显增多，含量也显著增加[7]。叶绿素降解产物新植二烯能增进烤烟的吃味和香气，降解转化形成致香成分[8-9]。有研究表明，弱光提高了中性挥发性致香物质总量，当光强减弱到一定程度，香气物质开始减少；其中新植二烯含量随光强减弱显著提高，而类胡萝卜素降解产物等所占比例下降[10-11]。史宏志等[12]研究表明，充足的氮素营养不仅有利于烟碱和总氮含量的积累，也可形成较多的类胡萝卜素类香气前体物[13]。目前已有的研究多集中在光照或氮素单因子对烤烟质体色素或香气质量的影响，氮素用量与光强相结合的研究以及在不同光氮条件下烤烟质体色素与品质指标间的关系研究较少，本文主要探讨光、氮二因素对烤烟质体色素及其降解产物、有机酸和碳氮代谢产物的影响，以期揭示不同生态条件下烟叶香气质量及品质形成的作用机制，进而通过氮素的调控，提高烟叶质量及香气品质，为今后有效地利用不同烟区光热资源，生产风格各异的优质特色烟叶提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

2011～2012年在河南农业大学科教示范园区（郑州毛庄）网室内，按120 cm×50 cm的行株距进行盆栽试验。塑料盆高27 cm，口径33 cm，底径21 cm。土壤经风干并熏蒸消毒，通过0.5 cm×1 cm网筛，每盆装土20 kg。供试土壤采自平顶山郏县，砂壤土，有机质 18.5 g kg–1，碱解氮 58.8 mg kg–1，速效磷 3.95 mg kg–1，速效钾 77.7 mg kg–1，pH 值 7.18。

还苗10 d后，利用不同层数的白色纱布遮阴，一直持续至采收结束。设置4个光照处理：L0，自然光强作为对照(100%光照强度)；L1，遮一层白纱布(80%光照强度)；L2，遮两层白纱布(70%光照强度)；L3，遮三层白纱布(50%光照强度)；生育期内平均光强分别为950～1125 µmol m–2s–1，770～900 µmol m–2s–1，610～720 µmol m–2s–1和 475～565 µmol m–2s–1。遮阴网距地面200 cm，以保证冠层通风条件良好，便于田间观测和取样。每个光照强度下分别设N1(1.5 g·pot–1)、N2(3.5 g·pot–1)、N3(5.5 g·pot–1)3 个氮肥梯度，利用烟草专用肥(m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1:1.5:2.5)，以最低施氮水平N1(1.5 g·pot–1)来计算其用量，不足的P、K肥用分析纯KH2PO4和K2SO4补充。在保证各处理P、K肥水平一致的条件下，添加分析纯NH4NO3实现3个氮素处理。氮肥和钾肥的70%于移栽前与土壤混合均匀后装盆施入，30%于移栽后25 d追施，磷肥在移栽前全部施入。每处理20盆，供试品种为豫烟5号。

1.2 材料与取样

烟株移栽后90 d，选取中部叶片(第11-13片功能叶)作为试验材料，每处理取3株，约 100 g，用冰盒保存带回实验室，用于叶绿素及类胡萝卜素含量的测定。烟叶经调制后，取C3F烟叶1 kg，去梗后在 60℃下烘干、碾碎过60 目筛，用于质体色素降解产物、有机酸及碳氮代谢产物的分析测定。所有测定指标每处理重复3次，取平均值。

1.3 质体色素及其降解产物的测定

鲜烟叶中叶绿素和类胡萝卜素含量采用80%丙酮提取法测定[14]；烤后烟叶中的质体色素降解产物利用美国HP5890Ⅱ-5972气-质联用仪进行定性、定量分析。采用“水蒸气蒸馏—二氯甲烷溶剂萃取”法制备得到分析样品，由GC∕MS鉴定结果和NIST02库检索定性，采用内标法定量。

1.4 有机酸含量的测定

使用美国HP5890Ⅱ-5972气-质联用仪采用内标法测定烟叶酸性成分。准确称取1.000 g烟样于100 mL锥形瓶中，加入500 µL内标，再加入25mL 10% 的硫酸甲醇溶液，振荡过夜后过滤到置有50 mL蒸馏水的250 mL分液漏斗中，摇匀，用二氯甲烷萃取三次，每次15 mL，收集萃取液于100 mL带塞锥形瓶中，加入无水硫酸钠干燥至少6 h。经前处理制备得到的分析样品，由GC∕MS鉴定结果。

1.5 碳氮代谢产物的测定

采用过氧化氢-硫酸消煮、凯氏定氮法测定总氮含量[15]；采用蒽酮比色法测定水溶性总糖和淀粉含量[15]；采用3，5—二硝基水杨酸(DNS)比色法测定还原糖含量[15]；采用气相色谱法测定烟碱含量，按Burton等[16]方法操作和设定参数。

1.6 数据处理

采用DPS7.05、Origin8.0 和Microsoft Excel(Office 2007)软件进行方差分析和显著性检验。

2 结果

2.1 不同光照条件下氮素对烟叶质体色素及其降解产物含量的影响

如表1所示，随光强减弱chla、chlb、chla+b、car含量呈增加趋势，不同光照处理间差异显著(F=627.47**，17.58**，1436.25**，23.92**)。随氮素水平提高质体色素含量增加，不同处理均以N3最高，说明施氮量增加可以维持较高的色素含量，有利于延长叶片的光合有效期，延缓烟株衰老。随光强降低Chla/b减小，说明弱光条件下烟株chlb含量增加的幅度高于chla，不同氮素处理间以N2处理的Chla/b最低，中氮水平下chlb含量增幅较大，有利于烟株在弱光环境中光能的吸收利用。不同氮素水平对chla、chlb、chla+b、car含量的影响差异显著(F=33.16**，16.08**，72.64**，31.13**)，光强与氮素的互作效应对chla、chla+b影响显著(F=2.70*，5.74**)。

表1 不同光照强度下氮素对烤烟质体色素含量的影响Tab.1 Effects of nitrogen on the plastid pigment content of flue-cured tobacco leaves under different light intensity

叶绿素降解产物新植二烯是烟叶中主要的萜类香气前体物质之一，如图1所示，随光强减弱其含量显著增加，以L3处理最高。自然光强下以中氮水平(N2)的含量最高，遮阴条件下新植二烯含量则随施氮量增加而升高，不同氮素处理间以中、高氮水平的烟株新植二烯含量较高，由于遮阴及增施氮肥促使叶绿素含量增加，因而在调制过程中叶绿素经分解、脱水最终形成的新植二烯含量也相对较高。各处理新植二烯含量占挥发性香气物质成分的总量在80% 以上。弱光环境有利于烟叶类胡萝卜素降解产物总量增加，不同光强间表现为：L2＞L1＞L3＞L0；自然光强下不同氮素间类胡萝卜素降解产物含量表现为：N2＞N3＞N1，而遮阴条件下则表现为：N3＞N2＞N1，其中，β-大马酮在类胡萝卜素降解产物中含量最高，占总量的26-57%。

光强、氮素对叶绿素降解产物的影响显著(F=7.58**，2.30**)，光强、光氮互作效应对类胡萝卜素降解产物具有显著影响(F= 10.20**，1427.91**)。叶绿素降解产物新植二烯与chla、chlb、chla+b、car含量存在极显著相关性，类胡萝卜素降解产物中β-大马酮、3-羟基-β-二氢大马酮、巨豆三烯酮Ⅲ、β-紫罗兰酮与car含量之间存在显著相关关系；chla+b含量对6-甲基-5-庚烯-2-酮、β-大马酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)、3-羟基-β-二氢大马酮、β-紫罗兰酮的影响显著(表2)。

图1 不同光照强度下氮素对烤烟叶绿素和类胡萝卜素降解产物的影响Fig.1 Effects of nitrogen on the degradation products of chlorophyll and carotenoid of flue-cured tobacco leaves under different light intensity

表2 烤烟质体色素与叶绿素、类胡萝卜素降解产物含量之间的相关性分析Tab.2 Correlation between the plastid pigment and the degradation products of chlorophyll and carotenoid of flue-cured tobacco leaves

2.2 不同光照条件下氮素对烤后烟叶有机酸含量的影响

随遮阴程度增加，多元羧酸含量呈明显增加趋势，自然光强下随施氮量升高其含量降低，而遮阴处理均以N3的含量最高，说明自然光强下低氮处理有利于多元羧酸积累，遮阴条件下增施氮肥有利于酸性成分积累。自然光强下，饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸总量随施氮量的增加而降低，而在遮阴条件下，中、高氮处理促进饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸含量的增加，L1以N3处理最高，L2、L3则以N2处理最高。低氮水平下，饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸含量随光强降低而减小，中、高氮水平下以遮阴处理的烟叶饱和脂肪酸含量较高。有机酸总量随光强降低而呈增加趋势，自然光照下随施氮量增加其含量升高，弱光条件下则以中、低氮处理下的有机酸含量较高，L2以N2处理最高，L1、L3均表现为：N1＞N3＞N2(图2)。光强、氮素两者的互作效应对多元羧酸、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸以及有机酸总量的影响均达到了极显著水平(表3)。

图2 不同光照强度下氮素对烤烟有机酸含量的影响Fig.2 Effects of nitrogen on the content of organic acids of flue-cured tobacco leaves under different light intensity

表3 不同光照强度下氮素对烤烟有机酸及碳氮代谢产物含量影响的显著性 F 检验Tab.3 F test of nitrogen effect on the organic acids content and the products in carbon-nitrogen metabolism of flue-cured tobacco leaves under different light intensity

2.3 不同光照条件下氮素对烤后烟叶碳氮代谢产物的影响

如图3所示，随光强降低和施氮量增加，烤后烟叶含氮化合物(总氮和烟碱)含量呈增加趋势，与之相反，碳水化合物(包括水溶性总糖、还原糖和淀粉)含量随光照强度降低而减少，这与遮阴降低了烟株的净光合速率，导致光合产物合成减少有关。随施氮量增加碳水化合物含量呈降低趋势：N3＜ N2＜ N1。总体来看，弱光使烟株氮代谢强度大于碳代谢。光强、氮素对含氮化合物和碳水化合物含量有极显著影响(表3)，两者的交互作用对碳水化合物的影响达到了极显著水平。将不同光、氮水平的烟叶质体色素降解产物与对烤烟品质有重要影响的酸性物质、含氮化合物和碳水化合物3个指标进行回归分析，得到最优的模拟方程(表4)。对回归方程求R2值并进行显著性测验，结果表明，叶绿素降解产物与碳水化合物含量之间的相关性最显著，类胡萝卜素降解产物与含氮化合物含量之间存在显著的指数相关关系，说明烟叶中新植二烯含量增加与碳水化合物的形成积累成正比；类胡萝卜素类香气成分增多的同时烟叶中总氮、烟碱含量也相应增加。

图3 不同光照强度下氮素对烤烟碳氮代谢产物的影响Fig.3 Effects of nitrogen on the prodcuts in carbon-nitrogen metabolism of flue-cured tobacco leaves under different light intensity

表4 质体色素降解产物与烤烟品质指标之间的回归分析Tab.4 The regression analysis between the degradation products of pigments and quality index of flue-cured tobacco leaves

3 讨论

特色烟叶形成于特定的光照条件下，其质体色素含量及各种化学品质指标受多种因素的综合影响，最终产生了具有不同香气风格特色的烟叶[17-19]。通过调控光强和氮素水平来调节烟株质体色素及其降解产物含量，进而能够影响烟叶的香气风格和品质。

(1)随光强减弱和增施氮肥烟叶中新植二烯含量增加，且占挥发性香气物质成分总量的80% 以上，一方面是由于氮素施用后叶绿素含量增加，在调制和醇化过程中叶绿素和叶绿醇大量转化为新植二烯；另一方面可能是光强降低后烟叶自身代谢产生变化，最终导致香气风格发生变化[20]。光强降低后，质体色素含量显著增加，chlb含量的增加幅度大于chla，弱光环境中烟株为捕获更多的光能，PSⅡ集光天线色素中富集chlb[21]，形成更多的捕光色素蛋白复合体(LHCP)[22]，提高了叶片的吸光强度和叶肉细胞的光合活性以维持正常的光合作用，但不利于烟叶适时成熟落黄。

(2)光氮互作效应对叶绿素及类胡萝卜素降解产物的影响达到极显著水平，在高等级的烟叶中类胡萝卜素及其降解产物含量通常较高[23-24]，本试验中，70%光照强度结合高氮处理的类胡萝卜素降解产物含量最高。自然光强下中、低氮水平的质体色素类降解产物含量较高，而遮阴处理随施氮量增加其含量升高。质体色素含量与叶绿素降解产物存在显著正相关关系，光强减弱后，新植二烯随施氮量升高而增加。施氮量直接关系到整个氮代谢的强弱[25-26]，氮素对光合碳固定代谢也有显著促进作用[27-28]，在低氮条件下，光合作用产生的三碳化合物主要用于可溶性糖和淀粉的合成，低氮处理的碳水化合物含量较高，含氮化合物含量较低；随着氮素水平的提高，烟株氮素同化能力增加，更多的三碳化合物流向氮素代谢，因而叶片中的总氮、烟碱含量增加，可溶性糖和淀粉含量下降，但在高氮或过量供氮条件下，植株的光合生产能力和氮素同化能力均有所下降，烟叶中碳水化合物含量明显下降，所以同一光照强度下中氮水平有利于烟叶优良品质的形成。

(3)光强降低后多元羧酸的含量和比例显著增加，而不饱和脂肪酸的含量和比例降低，有利于平衡烟叶酸碱度，使烟味柔和，劲头适中。弱光环境中氮肥的施用使烟株氮代谢增强，降低光强后有机酸含量的增加恰好弥补了烟碱、总氮等含氮化合物含量增高对烟叶品质的不利影响，挥发性酸能与生物碱结合成盐，调节质子化和游离态的烟碱比例，从而提高了烟气协调程度，改善烟气品质[29-30]。不同生态区烤烟香型风格的形成与光照强度、紫外线辐射强度、漫射光所占可见光比例、日照时数、温度及土壤水分条件等因素密切相关，不同香型风格的成因及作用机理有待于今后进一步探讨。

4 结论

随着光强减弱和氮肥用量的增加鲜烟叶中质体色素含量显著增加，有利于烟株吸收更多的光能以适应弱光环境。适度弱光 L2(610～720 µmol m–2s–1)接近烟株的饱和光强，能够促进类胡萝卜素降解产物的合成与积累，有利于烟叶香气品质的提高。过低光强会导致烟叶化学成分协调性的降低。

同一光照强度下中氮水平(N2，3.5g pot–1)有利于碳氮代谢产物及其衍生物的相互转化及平衡协调。

选择光生态条件最适宜其品质特色形成的地区，同时结合合理的施肥措施，才能确保烟叶优良品质和特色风格的形成。

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Effects of nitrogen supply on degradation products of plastid pigment and quality of flue-cured tobacco under different light intensity

YUN Fei,LIU Guoshun,SONG Jing
College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,National Tobacco Cultivation and Physiology and Biochemistry Research Center,Zhengzhou 450002,China

Effects of light intensity and nitrogen on degradation products of plastid pigment,organic acids components and substances in carbon-nitrogen metabolism were analyzed.Flue-cured tobacco cultivar Yuyan 5 was used in a pot experiment,with treatments of different light intensity and nitrogen supply levels.Results indicated that with application of nitrogen contents of neophytadiene and plastid pigments including chlorophyll a,chlorophyll b,total chlorophyll and carotenoid were significantly increased under shading,in the meantime,there was a significant positive correlation between plastid pigments and neophytadiene.Compared to high-nitrogen treatments which could promote formation of carotenoid degradation products under low light intensity,condition of mid-nitrogen and low-nitrogen levels facilitated accumulation of carotenoid degradation products under natural light intensity.Content of carotenoid degradation products reached the highest at 70% Light intensity(L2).Total content of multiple carboxylic acids was increased but the content of un-saturation fatty acid was decreased when light intensity decreased.Nitrogen application could improve amount of organic acids under shading and total content of saturation fatty acid reached the highest at high-nitrogen levels.Results also showed that the contents of nitric compounds increased in parallel with the rate of shading and nitrogen while the content of carbohydrate reduced.In general,nitrogen metabolism was slightly stronger than carbon metabolism.Regression analysis showed positive relationship between products of chlorophyll degradation and carbohydrate content reached most significant levels.There was a significant positive relationship between carotenoid degradation product and nitric compounds.Proper application of nitrogen could regulate plastid pigment components and improve aroma quality in fluecured tobacco under low light intensity.

light intensity; nitrogen; flue-cured tobacco; plastid pigment; quality

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.05.009

S572.01 文献标志吗：A 文章编号：1004-5708（2014）05-0051-08

国家烟草专卖局特色烟重大专项(No.110201101001)

云菲(1984—)，博士，主要从事烟草栽培生理研究，Tel:0371-63558128；Email:yunfeifei55@126.com

刘国顺(1954—)，教授，主要从事烟草栽培生理研究，Tel:0371-63558128；Email:liugsh1851@163.com

2013-08-01