典型生态区烟叶腺毛发育及其分泌物比较研究

杨永霞，魏跃伟，冯琦，王霄龙，王晶，赵宸楠，崔红

河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95号，450002

农艺与调制

典型生态区烟叶腺毛发育及其分泌物比较研究

杨永霞，魏跃伟，冯琦，王霄龙，王晶，赵宸楠，崔红

河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95号，450002

以烟草品种K326为材料，分别种植在河南平顶山、贵州遵义和云南江川三个典型生态区，在烟草叶片发育过程中对叶面腺毛形态、密度、腺毛分泌物及基因表达水平进行了比较研究。显微观察发现腺毛类型在3个地区间变化不大，都以长柄多腺头腺毛为主，但腺毛密度以贵州遵义产区的烟叶最高，河南次之，云南最低；GC/MS检测表明，西柏三烯二醇含量以河南产区为最高，且河南和云南产区随叶龄变化趋势相同；RT-PCR分析表明，西柏烷类化合物合成关键酶基因CYC-1和CYP71D16转录表达水平与西柏三烯二醇含量的变化趋势一致。该研究表明生态环境对烟草腺毛发育和物质代谢具有较大影响，叶面分泌物与烟叶风格特色密切相关。

烟草；腺毛；密度；分泌物；基因表达

烟草叶面腺毛浓密，则分泌旺盛。烤烟腺毛分泌物的主要成分为西柏烷类化合物，对烟草品种T.I 1068的叶面化学成分的分析表明，西柏三烯二醇含量占叶面总化学成分含量的60% 左右[1]。在叶片调制过程中，西柏烷类化合物降解产生茄酮、茄醇和降茄二酮等多种成分，与烟草香气密切相关[2]。烟草腺毛的生长发育及物质代谢和分泌受多种环境因子和栽培措施的影响，不同品种在不同肥料[3]、水分[4]以及光照[5]等条件下，腺毛的密度、类型以及分泌能力不同，而叶面化学成分的差异也是影响烟叶的香气品质和风格的主要因素之一[6-8]。我国地域辽阔，生态环境复杂，形成了以浓香型、清香型和中间香型为代表的烤烟类型[9]。浓香型烤烟以河南烟叶为代表，烟气浓郁，劲头适中，有杂气和刺激性；清香型烤烟以云南烟叶为代表，烟气清香淡雅、吸味舒适、烟味较淡、杂气轻微；中间香型烤烟以贵州烟叶为代表，烟气风格细腻柔和、杂气轻、刺激轻微、余味干净。目前，关于特色烟叶风格的形成机理方面的研究多集中在叶片发育、物质代谢规律等方面，而有关叶面腺毛的研究尚少有报道。为此，在河南平顶山、云南江川、贵州遵义烟区采用显微观察、GC/MS技术及RT-PCR技术，对栽培烟草K326叶片发育过程中叶面腺毛形态结构、分泌物含量及分泌物合成相关基因表达进行了系统研究，旨在明确不同生态烟区叶片腺毛发育和物质分泌的特点及其对烟叶特色风格的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种K326，分别种植在河南平顶山、贵州遵义和云南江川3个典型生态区，栽培管理按当地优质烟栽培技术规范实施。3个生态区均在烟株第12片（从下至上数）有效叶叶龄分别为10 d，20 d，30 d，40 d和50 d时取样(从叶片发生2 cm时即为叶龄第1天)，样品用于腺毛电镜扫描观察、叶面分泌物的提取测定及基因表达分析。

1.2 试验方法

1.2.1 叶面腺毛密度统计

选取从叶尖向叶基数第6～8支脉间，主脉至右侧叶缘之间的中央位置，取1 mm×2 mm大小的叶片组织，同时取多片作为重复样，将其迅速转移至4%戊二醛固定液（pH7.2）中固定，经过一系列乙醇脱水后，固定喷金，并使用Quanta 200扫描电镜（美国FEI公司）观察拍照，采用气体二次电子成像；工作电压15～20 kV，工作距离14.5～20 mm。腺毛密度统计时选取5个视野作为重复，并进行数据的统计分析。

1.2.2 叶面分泌物的提取检测

采用韩锦峰等[10]的方法分别在叶基部和叶中部于主脉两侧对称位置及叶尖沿主脉位置切取直径为10 cm的圆片共15片（幼叶取样时圆片直径为5 cm，圆片数增加到60片），并依次将圆片在1000 mL二氯甲烷中浸提，每次浸提2 s，重复3次，加入含正十七烷醇内标1 mL，得到的浸提液经过滤、旋转蒸发仪浓缩、氮吹仪吹干、硅烷化处理后，采用气质联用分析仪（色谱仪型号HP-5890，质谱仪型号vc-70SE）分离、分析，并通过检索谱库（NIST08）确定成分。分析条件：

色谱柱为DB-5MSUI石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度为250℃；程序升温：；载气为高纯氦气，载气流速为恒流0.8 mL/min；进样量为1.0 μL，分流比为15:1。传输线温度250℃；EI离子源温度280 ℃；电离能量70 eV；质量数范围50～650 amu。

根据圆片直径计算得出圆片总面积，使用Office Excel 2003进行结果的汇总，整理及图表处理。

1.2.3 叶面分泌相关基因表达分析

取3片来自不同烟株的中部叶，迅速放入液氮冷却，样品按照Invitrogen Trizol Reagent说明书提供方法提取烟草总RNA，样品通过随机引物法反转录合成cDNA。引物设计使用Premier Primer 5.0软件，根据Genbank发布的CYC-1，CYP71D16和L25（其中L25是烟草核糖体蛋白[11]，本研究中作为内参基因）序列设计各基因扩增引物。

表1 扩增引物序列Tab.1 Primer sequence for amplification

PCR反应体系为20 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共33个循环；72℃延伸10 min。PCR产物使用1.5 %琼脂糖凝胶进行检测，并观察拍照。

2 结果与分析

2.1 烟叶表面腺毛密度统计

利用显微技术对叶片发育过程中叶面腺毛的观察发现，3个地区腺毛类型均以长柄多腺头腺毛为主(图1)。腺毛密度随叶片发育呈现规律性的变化，如图2所示。在3个生态区，叶龄10 d时（图1）腺毛密度皆达到最高，随后急剧下降，这可能是由于叶片进入快速生长期，叶面积迅速扩展而引起。从叶龄20 d到40 d腺毛密度呈平缓下降的趋势。在叶龄50 d时密度又有明显的下降，这可能是由于烟叶进入成熟阶段，大量腺毛脱落所致，这与时向东[12]等的报道一致；但云南地区烟叶腺毛密度在叶龄50 d时有所回升，此现象李鹏飞[13]等也曾有报道，其原因尚不明确。三个生态区相比较，相同叶龄贵州产区的烟叶腺毛密度最高，河南次之，云南最低。

图1 叶龄10 d时叶片腺毛显微观察图Fig.1 micrograph of tobacco leaf trichome at 10 days leaf age

图2 不同叶龄烟叶腺毛密度的变化Fig.2 Densities of tobacco leaf trichome at different leaf ages

2.2 烟叶腺毛分泌物的检测

采用叶圆片法提取叶面化学物质，利用GC/MS共检测出47种物质，其中未知成分12种，已知成分35种。叶面化学物质中西柏烷类化合物是腺毛分泌物的主要成分，试验检测出的西柏烷类化合物包括α-西柏三烯一醇、β-西柏三烯一醇、α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇、以及四种西柏三烯二醇的同分异构体。此外还检测到多种烷烃和糖脂类物质，但是含量相对较低（见图3）。

图3 叶面化学各成分色谱分析图Fig.3 Chromatogram of chemical components on tobacco leaf surface

图4显示了三个生态区叶片腺毛主要分泌物西柏三烯二醇总量的积累变化规律。可以看出，随着叶片的发育，西柏三烯二醇含量呈现规律性变化，而云南和河南产区变化趋势趋于一致：在叶龄10d时西柏三烯二醇有较高水平的积累，随后降低，在叶龄30d达到最小值，随后逐渐上升，并在采收前下降。在贵州产区则有所不同，在叶龄20d时西柏三烯二醇积累水平较高，随后在叶龄40d时降至最低，之后缓慢上升。三地区间相比，河南产区烟叶中西柏三烯二醇含量较高，贵州其次，而云南含量相对较低。

图4 三个生态区烟叶腺毛分泌物西柏三烯二醇的含量比较Fig.4 Comparison of trichome excretion cembratriene-diol between different growing areas

2.3 西柏烷化合物合成相关基因表达分析

西柏三烯一醇合成酶（cembratriene-ol synthase，CYC-1）是将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸转化为西柏三烯一醇的关键酶[14]；西柏三烯一醇羟化酶（cembratriene-ol hydroxylase，CYP71D16），则 催化西柏三烯一醇向西柏三烯二醇的转化[15]，二者都是西柏烷类化合物合成的关键酶，与腺毛的物质代谢和分泌密切相关。以L25基因为内参，对叶片发育过程中这两个酶所对应的基因进行表达分析。结果如图5所示，从图中可以看出，随着叶片发育进程的推进，西柏烷类化合物合成相关基因的表达强度在云南和河南都是叶龄10d表达最强，之后减弱，河南地区在叶龄30d时又有所增强，在贵州则是叶龄20d表达最强，之后减弱，40d表达又有所增强。这与西柏三烯二醇含量的变化趋势一致。三个产区相比，河南、贵州烟叶腺毛分泌物合成相关基因的表达相对较强，云南最低。而在同一产区，所测定的两基因表达规律趋于一致，具有一定协同性。

图5 不同叶龄腺毛类萜代谢关键基因半定量表达分析Fig.5 semi-quantitative expression of key gene of trichome terpenoid metabolism in different age tobacco leaves

3 结论与讨论

烟草品种K326在三个生态区间叶片腺毛类型均以长柄多腺头腺毛为主，叶片腺毛密度和腺毛分泌物变化趋势相同。腺毛密度在叶龄10到20 d间急剧下降，之后逐渐保持平稳；烟叶腺毛分泌物含量随叶片的发育由高到低，缓慢上升并迅速下降，二者之间关系密切。叶片发育早期腺毛密度高，是导致腺毛分泌物含量较高的主要原因；随着叶片的迅速扩展，腺毛密度下降，分泌物含量也迅速降低；叶片发育后期，腺毛密度稳定，腺毛的结构发育成熟和代谢活跃是引起分泌物含量上升的主要原因；随着叶片的成熟，腺毛脱落，分泌物的合成代谢减弱，分泌物含量又开始下降。这与杨铁钊等[16]、Court等[17]的研究结果一致。对西柏烷类化合物合成关键基因CYC-1和CYP71D16的表达分析来看，随叶片发育进程的推进，基因表达呈现规律性的变化，这与西柏三烯二醇的含量变化趋势一致。

三个生态区中贵州产区不同叶龄叶片腺毛密度均明显高于河南和云南产区，这可能与贵州烟区叶片发育迟缓、叶面积相对较小有关。虽然K326品种在贵州产区的烟叶腺毛密度最高，但化学分析结果显示河南烟叶中腺毛分泌物西柏三烯二醇的含量占绝对优势，这与李章海等[18]的研究结果一致。他们的结果表明腺毛分泌物的主要降解产物——茄酮的含量在3个产区烤后烟样中以河南为最高，与其它两地区的差异达到极显著水平，并由此推测茄酮对浓香型烟叶特色风格具有重大影响，是主要的代表性物质成分之一。本实验结果支持了这一观点，但仍需要进一步的试验予以证实。河南烟叶在腺毛密度较小的情况下仍表现出了较高的腺毛分泌物含量，说明河南烟区烟叶腺毛物质合成、分泌更加活跃，CYC-1和CYP71D16基因保持了较高的转录水平也支持了这一推论。

[1]David D L，Nielsen M T．Tobacco production,chemistry and technology[M].Oxford:Blackwell Science，1999：292-303．

[2]史宏志,刘国顺．烟草香味学[M]．北京：中国农业出版社,1998：83.

[3]粱志敏,冀浩,崔红，等.施肥对烟草腺毛叶绿体体形态结构的影响[J].西北植物学报，2009，29(2)：291-295.

[4]张华，崔红,冀浩,等.水分胁迫对烟草腺毛超微结构的影响[J].中国烟草学报,2012,32(1)：4-8.

[5]翁梦玲,梁志敏,崔红,等.遮荫对烟草叶片腺毛形态结构及分泌物含量的影响[J].河南农业大学学报，2008,42(6):613-616.

[6]冀浩,李雪君,赵永振,等.浸提叶面分泌物对烤烟品质的影响[J].中国烟草科学,2008,29(2):13-17.

[7]查宏波,蔡忠山.不同烤烟品种烟叶腺毛 密度的差异性[J].烟草科技,2003(10):43-44.

[8]刘彩云,常志隆,常爱霞,等.普通烟草品种生长发育过程中叶表腺毛密度及其形态的比较[J].烟草科技,2011(5):71-73.

[9]唐远驹.试论特色烟叶的形成和开发[J].中国烟草科学,2004,25(1):10-13.

[10]韩锦峰,王广山,远彤,等.烤烟叶面分泌物的初步研究[J].中国烟草,1995,16(2):10-13.

[11]Schmidt G W,Delaney S K.Stable internal reference genes for normalization of real-time RT-PCR in tobacco(Nicotiana tabacum)during development and abiotic stress[J].Mol Genet Genomics,2010,283:233-241.

[12]时向东.烤烟叶片腺毛发育过程的扫描电镜观察[J].河南农业大学学报,2005,39(2):155-157.

[13]李鹏飞,周冀衡,张建平,等.不同烤烟品种成熟过程中腺毛密度及叶面分泌物含量的变化[J].湖南农业大学学报:自然科学版,2008,34(3):293-297.

[14]Wang E,George J W.Elucidation of the functions of genes central to diterpene metabolism in tobacco trichomes using posttranscriptional gene silencing[J].Plant,2003,216:686-691.

[15]Wang E,Wang R,DeParasis J,et al.Suppression of a P450 hydroxylase gene in plant trichome glands enhances naturalproduct-based aphid resistance[J].Nature Biotechnology,2001,19(4):371-374．

[16]杨铁钊.烤烟叶面腺毛密度及其分泌物变化动态的相关分析[J].中国烟草科学,2005,26(1):43-46.

[17]Court W A.Factors affecting the concentration of duvatrienediols of flue-cured tobacco[J].Tobacco Science,1982,24:40-43.

[18]李章海,王能如,王东胜,等.不同生态尺度烟区烤烟香型风格的初步研究[J].中国烟草科学,2009,30(5):67-70.

Comparative study in leaf trichome development and exudates in typical ecological regions

YANG Yongxia,WEI Yuewei,FENG Qi,WANG Xiaolong,WANG Jing,ZHAO Chennan,CUI Hong
College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China

Comparative study was conducted to determain trichomes morphology and densitites,exudates on leaf surface and gene expression by planting one tobacco(Nicotiana tabacumL.)variety K326 in three typical ecological regions,namely Pingdingshan of Henan province,Jiangchuan of Yunnan province,and Zunyi of Guizhou province.Results showed that no obvious difference was observed in trichome types,while trichome densities varied greatly between regions.Leaf trichome in Guizhou’s Zunyi proved to have the highest density,followed by that in Henan and Yunnan.Cembratriene-diol(CBT-diol),the main component of trichome exudates,registered the highest in tobacco leaf surface in Henan according to GC/MS..The expression ofCYC-1 and CYP71D16displayed same tendency with CBT-diol content.It indicated that ecological environment influenced development of leaf trichomes and metabolism,and further affected characteristics of tobacco leaves.

tobacco; trichome; density; exudate; gene expression

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.05.007

S572.01 文献标志码：A 文章编号：1004-5708（2014）05-0038-05

中国烟草总公司重点科技项目“烟草腺毛物质代谢相关基因表达规律及调控研究”（110200902045）

杨永霞（1980—），博士，讲师，研究方向为烟草生物技术，Tel：0371-63558121，Email：yyx624@126.com

崔红（1966—），博士，教授，研究方向为烟草生物技术，Email：cuihonger_13@163.com

2013-11-23