新疆地区维、汉民族缺血性卒中与ADP基因多态性的相关性研究①

张震中 梁晓鹰 吕光耀 姚 华(新疆医科大学，乌鲁木齐 830054)

脑卒中目前是导致人类死亡的三大疾病之一，脑卒中是遗传因素和环境因素共同作用的多基因病，确定脑卒中的易感基因乃至找到关键基因，可以从分子水平对脑卒中的发病机制有进一步认识，由于脑卒中是多基因病，在检测多基因病的多个基因微效效应方面，候选基因关联分析主要是选择与多基因疾病有生物学联系的基因或者与该疾病已知相关基因具有同源性的基因作为候选基因，研究该候选基因与该疾病的发病是否具有相关性。荟萃分析结果提示脂联素基因单核苷酸多态性与脑卒中之间存在着显著的关联［1］。一项Meta分析提示脂联素水平降低与脑卒中的发生密切相关［2］。胡晓波等［3］研究发现脂联素基因-3971A/G多态性的 GG型可能是缺血性卒中发病的一个独立危险因子。脂联素(Adiponectin，APN)是新近发现的脂肪组织特异性分泌的激素蛋白，研究表明APN在多种疾病的发生、发展过程中发挥抵抗作用，是一种保护性脂肪因子［4，5］。APN 具有血管内皮保护作用，增加内皮源性NO的产生与释放［6］。APN增加脂肪酸的氧化，降低血TG水平，减少脂质沉积，促进巨噬细胞的裂解，从而抑制血管平滑肌细胞和外周血单核细胞的增殖及巨噬细胞向泡沫细胞的转变，抑制动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)的形成［7］。临床研究表明，缺血性卒中患者血清APN水平较健康对照组显著降低［8］。

新疆属我国的脑卒中高发地区，存在明确的民族及环境特征，由于动脉粥样硬化是心脑血管最为常见的共同病因基础，本研究定位于脂质代谢相关的脂肪细胞因子Adiponectin，对新疆维汉民族缺血性脑卒中患者进行脂联素基因多态性及其相关的研究，通过分子生物学原理研究其与脑卒中的相关性及其在维汉民族之间有无差异。

1 材料与方法

1.1 研究对象和分组

1.1.1 病例组 所有入选的研究对象均来源于2011年3月至2013年3月在新疆医科大学附属中医医院神经内科及喀什地区第一人民医院神经内科的住院病人210例，其中汉族121例，平均年龄(58.71±9.32)岁，男67例，女54例;维吾尔族89例，平均年龄(57.44±10.15)岁，男53例，女36例。全部均符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》［9］的急性脑卒中的诊断。

1.1.2 对照组 同期在新疆医科大学附属中医医院体检人群104例，其中汉族47例，平均年龄(55.21±10.92)岁，男26例，女21例;维吾尔族57例，平均年龄(56.24±11.37)岁，男34例，女23例;所有患者均排除脑血管病、自身免疫性疾病、肝肾功能不全和恶性疾病。

1.2 研究方法 对符合纳入标准的维族、汉族缺血性脑卒中患者和对照组人群抽取血样，进行DNA提取，统一进行基因检测工作。实验步骤:(1)通过haploview软件，设定 Taggle_SNPs，筛选 MAF＞0.5以上的SNPs位点信息并与之前查找的基因进行比对，确定本次研究所需SNPs位点信息。(2)基因DNA提取:所有研究对象均取外周血采用苯酚氯仿抽提法。见图1。(3) SNaPshot技术检测Adiponectin基因SNPs。(4)引物设计及合成:根据SNP位点序列信息，使用Premier 5.0软件设计、扩增、延伸并合成引物。(5)PCR反应体系:10 μl PCR 反应体系:2.5×Buffer 4.0 μl，上游引物(10 μmol/L)0.2 μl，下游引物(10 μmol/L)0.2 μl，Tag(5 U/μl)0.1 μl，DNA(50～ 100 ng/μl)1.0 μl，ddH2O 4.7 μl。扩增程序:95℃ 5 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s×32 cycles;72℃ 8 min。预扩增产物质检:取2 μl上样，2%琼脂糖凝胶电泳。(6)3730XL测序仪检测:①96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液(0.5、8.5)9 μl，PCR 产物0.8 μl;②95℃变性3 min，上机检测;(7)PCR直接测序:直接测序是确定突变位点碱基的金标准，由北京阅微基因生物公司完成测序和测序峰图。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件，计数资料的比较采用χ2检验，基因型和等位基因频率的比较采用χ2检验。Hardy-weinberg平衡检验采用拟合优度χ2检验。

2 结果

2.1 Adiponectin基因3个位点Hardy-weinberg平衡检验结果 分别对病例组和对照组ADP基因SNP位点分型采用了拟合优度卡方检验，计算其Ho、He，结果显示病例组和对照组基因SNP位点基因型频率分布没有偏离Hardy-weinberg平衡(P＞0.05)(表1)，因此我们选取的样本人群具有代表性适合做遗传学分析。

2.2 Adiponectin基因3个位点SNaPshot方法判定基因类型 使用SNaPshot方法进行SNP位点测序，峰值图见图2～4。

图1 电泳结果Fig.1 Electrophoresis results

表1 Adiponectin基因Hardy-weinberg平衡检验结果Tab.1 Results of Adiponectin gene Hardy-weinberg equilibrium test

2.3 病例组与对照组Adiponectin基因频率比较将两组研究对象分为病例组和对照组后，根据不同基因SNPs位点进行比较，从表2中可以看出，rs6444175G/A位点基因频率分布有统计学差异(χ2=13.882，P=0.001)。由于病例组rs6444175G/A基因型GA频率(44.3%)高于对照组(23.1%)，因此对rs6444175G/A位点GA基因型进一步进行统计学处理，如表3所示，应用条件Logistic回归校正传统危险因素，如高血压、糖尿病、冠心病、高脂血、吸烟，GA基因型频率病例组明显高于对照组，差异有统计学意义(OR=1.269;95%CI:1.001～1.952;P=0.012)，提示rs6444175GA基因型是缺血性脑卒中的独立危险因素，患缺血性脑卒中的风险率增加至1.269倍。

2.4 维、汉族人群病例组和对照组 Adiponectin基因型频率比较 维、汉族人群与其对照组进行比较，Adiponectin 3个SNP位点基因型类型分布，通过χ2检验，未见显著差异。但从表4中可以看出，维吾尔族rs182052基因型CC+CT病例组中占到85.2%，对照组中占到84.2%;rs6444175基因型GG+GA病例组中占到89.9%，对照组中占到92.9%;rs1501296基因型GA+AA病例组中占到89.9%，对照组中占到87.7%;与整组研究对象相比，维族人群中病例组与对照组各个SNP位点基因型分布呈一致性。

图2 Adiponectin SNPrs182052测序峰值图Fig.2 Adiponectin SNPrs182052 sequencing peak figure

图3 Adiponectin SNP rs6444175测序峰值图Fig.3 Adiponectin SNP rs6444175 sequencing peak figure

图4 Adiponectin SNP rs1501296测序峰值图Fig.4 Adiponectin SNP rs1501296 sequencing peak figure

2.5 病例组和对照组Adiponectin等位基因频率比较 等位基因水平研究结果显示，病例组与对照组比较，Adiponectin基因rs6444175G/A等位基因A在病例组中携带频率明显高于对照组，当个体携带A等位基因时，病例组的相对患病风险率显著增加至1.481倍(OR=1.481;95%CI:1.219～1.910;P=0.000)(见表5)。

2.6 维、汉族人群病例组和对照组 Adiponectin等位基因频率比较 维、汉族人群中病例组与对照组比较发现，Adiponectin各位点等位基因频率分布未见明显差异，均无统计学意义(见表6)。

表2 病例组与对照组Adiponectin基因型频率比较〔n(%)〕Tab.2 Comparison of Adiponectin genotype frequency in cases and controls〔n(%)〕

表3 rs6444175GA基因型条件Logistic回归校正结果Tab.3 Results of rs6444175GA genotypes of conditional Logistic regression calibration

表4 维、汉族病例组和对照组Adiponectin基因型频率比较［n(%)］Tab.4 Comparison of Adiponectin genotype frequency in Uygur，Han case and control groups［n(%)］

表5 病例组和对照组Adiponectin等位基因频率比较Tab.5 Comparison of Adiponedtin allele frequency in case and control group

表6 维、汉族病例组和对照组Adiponectin等位基因频率比较Tab.6 Comparison of frequency of Adiponectin allele on Uygur and Han case and control groups

3 讨论

现代分子生物遗传学证实多数疾病都是由特定的基因来调控的，本次研究选取与脑卒中相关糖脂代谢相关的基因，即脂联素基因，通过分析脂联素SNP rs182052、rs6444175、rs1501296位点的相关性，试图找寻其与缺血性脑卒中之间的关系，并筛查其产生的基因型及等位基因与疾病的敏感度，并从维汉民族缺血性脑卒中的基因型特点上探讨其基因位点有无差异。

3.1 维、汉民族脂联素基因多态性与缺血性脑卒中危险因素之间的关系 Adamczak等［10］首次报道了脂联素与原发性高血压(EH)之间的关系，结果显示EH患者脂联素水平明显低于正常对照组，在所有研究对象中血清脂联素水平与血压水平呈负相关，推论脂联素可能与高血压的临床进程有一定的关系。研究表明，高血压患者血浆脂联素水平较血压正常者明显降低，并与收缩压、舒张压和平均动脉血压均成负相关，脂联素是发生高血压的独立危险因素。相关研究提示脂联素T45G多态性与T2DM的相关性可能存在种族差异［11］，新疆维吾尔族的T2DM高发是汉族的2倍，其SNP276多态性位点与T2DM相关;2型糖尿病患者血浆脂联素浓度明显低于正常人群，血浆脂联素水平降低与胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍的病理生理改变具有一定的相关性，脂联素是糖尿病发生发展的重要生物学标志物［12，13］。何慧婧等［14］研究发现脂联素基因SNP 45多态性与凉山州汉族居民2型糖尿病的关联尚不确定。Bang等［15］对231例脑梗死患者的研究发现，代谢异常的患者血清脂联素水平较低(P=0.002)，而且卒中类型不同血清脂联素水平亦不相同。杨秀娟等［16］收集动脉粥样硬化性脑梗死患者的血标本，发现276G/T多态性可能参与中国湖南汉族人群动脉粥样硬化性脑梗死的发生，且可能影响血脂水平;Chen等［17］研究证实:APN通过NF-κB信号通路起到明显抗炎效应，降低脑缺血再灌注损伤，表明具有神经保护作用，APN是潜在的治疗缺血性脑梗死的分子靶点。脂联素还可通过提高肝脏合成高密度脂蛋白而促进胆固醇的逆行转运，高密度脂蛋白除具有胆固醇逆转运功能外，还具有抗氧化和抗炎症作用。

3.2 维、汉族缺血性脑卒中脂联素基因多态性分析

本次研究纳入了维族和汉族人群，使用SNaPshot技术检测脂联素基因3个 SNP位点:rs182052、rs6444175、rs1501296，研究发现SNP位点均呈二态性分布。其中维族Adiponectin基因SNP rs182052位点，在整组人群中，CT型占绝大比例，TT型为最少;rs6444175位点中以 GA型最多，AA型最少;rs1501296位点，以AA型居多，GG最少，但3个位点病例组和对照组均无明显差异。其中汉族Adiponectin基因 SNP rs182052位点，在整组人群中，CT型占绝大比例，TT型为最少;rs6444175位点中以GG型最多，AA型最少;rs1501296位点，以GA型居多，GG最少，但3个位点病例组和对照组均无明显差异。Adiponectin基因SNP rs182052位点等位基因，维、汉族人群均以 C等位基因为主;rs6444175位点等位基因，两组均以G等位基因居多;rs1501296位点等位基因，整组人群均以A等位基因为主，但均未见显著差异。本研究首次报告了新疆维、汉族缺血性卒中人群ADP基因多态性，此次的研究工作，发现脂联素3个SNP位点的基因型、等位基因频率均未见明显差异，原因考虑可能与样本量较少和对缺血性卒中的纳入标准存在差别有关，需进一步做深入研究。

3.3 病例组与对照组脂联素基因多态性分析 研究病例组与对照组两组对象发现rs6444175G/A位点基因频率分布有统计学差异(χ2=13.882，P=0.001)，由于病例组rs6444175G/A基因型GA频率(44.3%)高于对照组(23.1%)，因此对rs6444175G/A位点GA基因型行进一步统计学处理，和基因型GG、AA比较，GA基因型频率病例组明显高于对照组，应用条件Logistic回归校正传统危险因素后，差异有统计学意义(OR=1.269;95%CI:1.001～1.952;P=0.012)，提示 rs6444175GA基因型是缺血性脑卒中的独立危险因素，患缺血性脑卒中的风险率增加至1.269倍。通过对病例组人群脂联素的3个SNP位点的等位基因频率进行研究，发现部分差异:病例组人群中 Adiponectin SNPrs6444175等位基因 A频率高于对照组，P=0.000，OR=1.481，可能为缺血性脑卒中的易感基因位点。说明缺血性脑卒中患者存在着明显的基因位点变异。

综上所述，通过研究发现，缺血性脑卒中Adiponectin基因rs6444175G/A等位基因A可能是其发病的易感基因位点，而维汉民族之间，虽然在基因型分布上两组人群未存在显著差异，但在基因位点发现不同SNP位点基因型，存在显著差异，具有统计学意义，说明两组人群存在一定的民族异质性，这种差异可能需要我们在以后的研究中进一步寻找相关的基因位点进行研究，脂联素基因位点多态性差异应该是维、汉民族脑卒中发病的重要危险相关因素。本研究对新疆地区维吾尔族和汉族在缺血性卒中患者ADP基因的多态性进行分析，探讨了其与缺血卒中的关系。发病上可能有不同的遗传易感因素，但对ADP基因与缺血卒中的确切关系以及它是如何与其他致病基因相互作用引发缺血卒中的，仍有待进一步研究。

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