黄曲霉毒素M1人工抗原的制备及鉴定①

蔡齐超 侯玉泽 邓瑞广 胡骁飞 王 耀 张小帆 王方雨

(河南科技大学食品与生物工程学院，洛阳 471003)

黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM1)是目前发现最稳定的一种真菌毒素，具有二呋喃环结构，在365 nm的紫外线下可发出蓝紫色的荧光［1，2］。AFM1的毒性很大，是氰化钾的5倍，砒霜的40倍［3，4］。国际癌症研究机构也一再提升AFM1的致癌等级，已从1993年的二类致癌物质提升为2002年的一类致癌物［2，5］。由于黄曲霉毒素M1大多见于婴幼儿奶粉及其他乳制品中，而且目前缺乏行之有效的防治措施和去毒方法，因此世界各国均制定了严格的毒素残留标准［6，7］。中国和俄罗斯要求在乳及乳制品中，黄曲霉毒素M1的最高限量为0.5 μg/kg;而日本和欧盟的要求更高，其最高限量为0.05 μg/kg［8］。目前检测 AFM1 残留的方法很多，主要包括薄层层析法(TLC)、高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS)和酶联免疫吸附法(ELISA)等［9-15］。由于TLC只能定性不能定量，而且所需时间长;HPLC操作复杂，仪器昂贵，并且对检测样品性质要求较高，所以它们都不适于现场大规模的检测。而免疫学快速检测方法因其特异性高、敏感性好、快速简便、对样品要求低等优点，在小分子抗原检测中具有非常广阔的前景。抗体是免疫学检测不可或缺的生物性原材料，人工抗原是抗体制备的前提，因此，成功合成AFM1人工抗原就显得尤为重要，这为AFM1单克隆抗体制备及AFM1免疫学快速检测试剂的研制奠定了坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 溶液 溶液PBS(Phosphate buffered saline，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液)，洗液 PBST(PBS∶Tween20=2×103∶1)，包被液 CBS(Carbonate buffered saline，0.05 mol/L NaHCO3/Na2CO3缓冲液)，封闭液(PBST∶猪血清=20∶1)，TMD 底物缓冲液，终止液(2 mol/L H2SO4)。

1.1.2 试剂 黄曲霉毒素 M1(Aflatoxin M1，AFM1)，Sigma产品，纯度≥98.0%;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，Thermo scientific公司产品;BSA和 OVA，弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)和弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)，Pierce 产品;羊抗兔酶标二抗(GaRIgG-HRP)，华美生物工程有限公司;试验用双蒸水(ddw)由本实验室制备;其他所用试剂均为市售AR(分析纯)级。

1.1.3 仪器 U-3000紫外扫描仪(UV)，日本岛津公司;3K-18高速冷冻离心机，德国Sigma公司;Bio-Rad-550型酶标仪，美国Bio-Rad公司;HI9321酸度计，美国 HANNA公司;AE260电子天平，德国METTLER公司;ZF-7三用紫外分析仪，巩义予华仪器有限责任公司;XMTD-8222电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司;JM-250电泳仪，大连捷迈科贸有限公司;超纯水仪，Millipore产品。

1.1.4 试验动物 购自郑州大学医学院实验动物中心的6周龄雌性BALB/c小鼠，均为SPF级，由河南省动物免疫学重点实验室饲养。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原的合成

1.2.1.1 AFM1肟(AFM1O)的制备 将2 mg的AFM1和4 mg的氨氧基乙酸半盐酸盐(CMO)溶于2 ml吡啶甲醇水的混合液中(吡啶∶甲醇∶双蒸水=1∶4∶1)，控温(120℃)回流，薄层色谱法监测反应进程。待反应完全，用旋转蒸发仪将溶剂旋干，加入2 ml ddw溶解，用2 mol/L的H2SO4调节pH=4，再用5 ml乙酸乙酯萃取2～3次，合并有机相，并用 ddw洗涤2次，再次旋干液体，得到的黄色油状物质即是AFM1O。

1.2.1.2 完全抗原的制备 AFM1-BSA的制备:用0.4 ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解 AFM1O，取0.2 ml再加入0.3 ml ddw配成N，N-二甲基甲酰胺和水(DMF∶H2O=2∶3)的混合溶液，加入 1 mg EDC，室温避光活化4 h后，再补加1 mg EDC，此为A液。称3.35 mg BSA，用0.13 mol/L的 NaHCO3溶液(2.76 ml)制成10%BSA活化溶液，此为B液。将B液逐滴加入到A液中，避光搅拌24 h。在4℃下用PBS搅拌透析3 d，每天换液4次，离心去沉淀获得纯化的AFM1-BSA［16，17］。AFM1O-OVA 的 制备:方法同上，用 OVA(2.13 mg)取代 BSA，得到AFM1O-OVA，反应方程如图1。

1.2.2 薄层层析法鉴定 将肟化物用少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解，以10 ml氯仿和甲醇的混合液(氯仿∶甲醇=9∶1)为展开剂，用铅笔在硅胶板上画两道线，用毛细管在一条线上点样，插入盛有展开剂的容器中，点样线在下但高于液面。在展开剂层析到另一条线时，取出硅胶板，在暗室中，用365 nm的紫外分析仪照射，观察并记录亮斑反应方程如图2。

1.2.3 紫外扫描鉴定 用PBS配制AFM1、BSA和OVA标准溶液，调节合成抗原的浓度与标准溶液相一致，用紫外扫描仪测定，在波长220～440 nm范围内得到最大吸收峰及特征值。

1.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳鉴定 按照文献［18］介绍的方法配制所需电泳溶液。基于所分离蛋白比较单一，且分子量相当大，选择电泳条件:浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%，浓缩胶电压90 V，分离胶电压100 V，上样量为20 μl，考马斯亮蓝染色4 h后，置脱色液中脱色，为加快进程，可更换2～3次脱色液。

1.2.5 免疫学方法(ELISA)鉴定

1.2.5.1 动物免疫 取高压PBS溶解AFM1-BSA至50 μg/ml，与等量弗氏完全佐剂(首免用完全佐剂，之后用不完全佐剂)混合，用乳化器充分乳化后，免疫小鼠。小鼠背部皮下6点注射，免疫剂量为0.2 ml/只，共免4次，免疫间隔为21 d。三免后10 d 断尾采血 10 μl至 990 μl PBS 中，4 000 r/min 离心取上清，4℃保存备用。

1.2.5.2 包被板的制备 首先，AFM1-OVA包被，包被浓度和包被量分别为 5 μg/ml和 50 μl/孔，37℃温育2 h，PBST洗板5次;然后，用5%猪血清封闭220 μl/孔，37℃温育1 h，PBST 洗5 次，晾干后4℃保存。

1.2.5.3 多抗血清(pAb)效价测定 采用间接ELISA方法测定多抗血清效价。第一步，用5%猪血清铺底50 μl/孔，在第一行加小鼠血清 50 μl/孔，倍比稀释到倒数第二行，设阴性对照(NC，即用未免疫AFM1-BSA的小鼠血清)和空白对照(BC)，37℃温育15 min，洗5次;第二步，加GaMIgG-HRP，用5%猪血清1∶1 000 倍稀释，50 μl/孔，37 ℃温育 30 min，洗 6次;第三步，加TMB显色50 μl/孔，室温反应10 min;第四步，加 2 mol/L H2SO4终止反应 50 μl/孔，读OD450;第五步，结果判断:以待测孔 OD450值≥NC OD450值的2.1 倍(P/N≥2.1)，判为阳性［19］。

1.2.5.4 多抗血清(pAb)抑制价测定 采用阻断ELISA鉴定pAb抑制价。方法与1.2.5.3基本相同，只是第一步略有不同，改为用5%猪血清铺底50 μl/孔，加 OD450为 1.0左右的小鼠血清50 μl和不同浓度的 AFM1标准品作抑制剂，设NC和 BC，37℃温育15 min，PBST洗5次。最后计算抑制率(B/B0，B0为 AFM1浓度为0时的OD450，B为不同浓度 AFM1的 OD450)。以 B/B0为纵坐标，以AFM1浓度的对数值为横坐标，绘制抑制曲线，根据曲线趋势推导回归方程，计算小鼠多抗血清对AFM1的50%抑制浓度(IC50)，以 IC50衡量其敏感度［20］。

2 结果

2.1 TLC鉴定肟化物 由图3可知，迁移距离较远的是 AFM1标准品，迁移距离较近的为肟化物AFM1O。AFM1与CMO的反应完全时间很难确定，但是TLC能够确定肟化反应的进程，所以采用TLC可以确定AFM1与CMO反应完全的时间。在查阅的文献中，回流反应的时间有很多，有回流2 h、2.5 h、3.5 h、4 h和5 h。本实验用TLC确定反应进程，自回流2 h后开始检测。图3A是还未开始反应时的TLC检测，点样AFM1标品和混合液。图3B是在肟化反应2 h时TLC检测，点样AFM1标品和混合液。图3C是肟化反应2.5 h时TLC检测，点样AFM1标品和混合液。

2.2 UV鉴定人工抗原 用U-3000紫外扫描仪对AFM1、BSA、AFM1-BSA 在 220～440 nm 波长范围进行扫描。由图4可看到BSA在280nm处有吸收峰，AFM1在262 nm处有吸收峰，而偶联物AFM1-BSA在274 nm处出现最大吸收峰，与BSA和AFM1的最大吸收峰均不重合，证明偶联成功。

图1 AFM1O的制备Fig.1 Preparation of AFM1O

图2 AFM1人工抗原和检测抗原的制备Fig.2 Preparation of AFM1 artificial antigen and coated antigen

2.3 SDS-PAGE鉴定人工抗原 由图5可知，AFM1-BSA的泳动速度小于BSA，而且有较明显的扩散现象，说明BSA的分子量小于AFM1-BSA，证明AFM1与BSA偶联成功。

2.4 ELISA鉴定人工抗原

2.4.1 ELISA测定pAb效价 由表1可知，免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到了1×10－4，其中1号小鼠最高，达到1∶1.28×104，说明用 AFM1-BSA 免疫小鼠能够获得较好的免疫效果。

2.4.2 阻断ELISA测定pAb敏感性 选取抑制最好的3号小鼠做标准抑制曲线。由图6可知，3号小鼠的标准抑制曲线的线性回归方程为y=－0.246 5x+1.130 1，相关系数 R2=0.970 4，IC50=359.9 ng/ml，表明3号小鼠的血清对AFM1具有较高的敏感性。说明免疫抗原和检测抗原均偶联成功。

表1 3只小鼠pAb间接ELISA效价测定结果Tab.1 Titers of polyclonal antibodies of three BALB/c mice detected by indirect ELISA

图3 AFM1和AFM1O的薄层色谱图Fig.3 TLC of AFM1 and AFM1-BSA

图4 BSA、AFM1和AFM1-BSA的紫外扫描光谱Fig.4 UV scanning spectrum of BSA，AFM1 and AFM1-BSA

图5 AFM1-BSA偶联物的SDS-PAGE鉴定Fig.5 Identification of AFM1-BSA conjugation by SDSPAGE

图6 阻断ELISA检测3号小鼠AFM1 IC50Fig.6 IC50inhibitive curve of mice 3 AFM1 polyclonal antiserum by competitive ELISA

3 讨论

3.1 AFM1抗原偶联方法 AFM1是小分子物质，属于半抗原，即只有反应原性，无免疫原性，因此只有将其与具有免疫性的大分子载体蛋白偶联后，才能形成完全抗原。由于AFM1分子构象中并没含有羧基等易与载体蛋白相结合的基团，故本实验采用肟化法在AFM1分子构象上添加一个羧基，以便接下来用碳化二亚胺法(EDC)分别制备出免疫抗原和检测抗原。

3.2 TLC确定肟化完全 本文采用TLC法来确定肟化反应的进程。AFM1和CMO回流反应，反应完全时间很难确定。本实验将AFM1和CMO在双头烧瓶进行回流，这可方便取液检测。TLC确定反应进程，自回流2 h后开始检测，每隔0.5 h TLC检测，在2.5 h时已经完全反应。用TLC确定了反应物完全肟化，不仅缩短了试验时间，提高了效率，而且还减少了加热时间过长引起的许多副反应的发生。

3.3 AFM1偶联物的鉴定 鉴定免疫抗原和检测抗原的方法一般有紫外扫描光谱法、SDS-PAGE电泳法和 ELISA法。通过紫外扫描，可知偶联物AFM1-BSA和AFM1-OVA的最大特征吸收峰与BSA、OVA的最大吸收峰及AFM1的最大吸收峰均不重合，证明AFM1-BSA和AFM1-OVA合成成功。因为AFM1-BSA和AFM1-OVA与BSA和OVA的分子质量不同，采用SDS-PAGE凝胶电泳跑蛋白胶，它们的泳动速率也会不同，AFM1-BSA和BSA、AFM1-OVA和OVA能明显错开，所以证明AFM1-BSA和AFM1-OVA合成成功。ELISA法是将制备的免疫原免疫小鼠，均获得良好效价，做敏感性实验时，3号小鼠的IC50达到了359.9 ng/ml，这也证明小分子AFM1偶联载体蛋白成功。

本实验合成并鉴定了AFM1的人工抗原，获得敏感性好、特异性强的多克隆抗体，为进一步筛选AFM1单克隆抗体和研制AFM1快速检测试剂盒或试纸条打下了良好的基础。

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