GM-CSF和EB病毒LMP2A融合基因的表达及抗肿瘤特性研究①

薛庆节 赵 强 司传平 陈 廷(济宁医学院医学免疫学省级重点学科，济宁 272013)

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)属疱疹病毒科γ病毒亚科，是重要的DNA病毒，能够导致人类肿瘤。大多EB病毒第一次感染人后没有明显的症状，但是人一旦感染，将终身携带该病毒。在以后的生活中由于环境等因素的影响一旦病毒被活化，就可能引起肿瘤。研究发现，EB病毒与许多人类恶性肿瘤相关，包括胃癌、霍奇金淋巴瘤、Burkitt's淋巴瘤、鼻咽癌(NPC)等［1，2］。本研究拟将前期实验中构建成功的GM-CSF和EB病毒LMP2A融合基因腺病毒载体vAd-GC2A，进行免疫学实验研究，检测融合基因GC2A的表达及功能，为协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 腺病毒pAdTrack-CMV与pAdEasy-1购自北京普如汀生物有限公司;QBI-293A细胞为本室保存，EB病毒阳性胃癌细胞GT39由青岛大学罗兵教授馈赠，乳酸脱氢酶底物溶液(Roche公司)、非放射性CTL杀伤活性检测试剂盒、DNA连接酶、DNA聚合酶购于 Promega生物公司，EcoR I、DNA Marker、BamH I、Sal I为博亚产品;T4DNA 连接酶、Taq酶及各种限制性内切酶为TaKaRa公司产品;乳酸脱氢酶试剂盒为南京建成生物工程研究所产品;淋巴细胞分离液购自Pharmacia公司;GM-CSF、IL-2、IL-4购自Sigma公司;GM-CSF及LMP2A抗体购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2 方法 重组腺病毒融合基因(被命名为vAd-GC2A)的构建和包装方法见文献［3］。

1.2.1 反转录PCR检测重组腺病毒GC2A基因的表达 以vAd-GC2A感染EB病毒阳性293细胞，4 d后收集所培养细胞，1 000 r/min离心10 min(离心半径10 cm，温度4℃)去上清液，提取细胞总RNA，所获产物加入DNasel消化处理后进行反转录PCR。LMP2A引物设计如下:LMP2A上游引物F6:5'-GGAGATCTATGGGGTCCCTAGAAATGGTG-3'，下游引物F4:5'-GCGATATCTACAGTGTTGCGATATGGGGT-3'，电泳鉴定结果显示，扩增产物为1 545 bp。取6 μl细胞离心后的上清作模板，进行反转录PCR反应(用EBV阳性人胃癌细胞GT39作对照)，反应条件同文献［4］，PCR产物进行琼脂糖电泳检测。

1.2.2 重组腺病毒感染EBV阳性胃癌细胞 将150 μl EBV阳性胃癌细胞GT39悬液(约5×103个)置于96孔板中，37℃培养过夜，待细胞贴壁后接种相同滴度的病毒，试验设vAd-GC2A及未感染组，每组设4个平行，分别于接种病毒 0、24、48、72、96 和120 h时，于荧光显微镜下检测荧光强度。

1.2.3 蛋白质印迹法检测重组腺病毒GC2A基因表达(1)样品制备:vAd-GC2A感染EBV阳性人胃癌细胞GT39，37℃吸附培养1 h后，补足培养液，4 d后收获细胞，加2 ml裂解液，37℃、－80℃反复冻融4次，4℃12 000 r/min(离心半径10 cm)离心5 min，收集上清液(蛋白)。(2)处理后的蛋白进行8%SDS-PAGE电泳，然后取出凝胶，测大小后在转膜缓冲液中平衡1 h。准备PVDF膜，各边可略大于凝胶1～2 mm。将膜浮于去离子水中约10 min，并将6张滤纸在转移缓冲液中浸泡备用。在阳极上先后叠放3张滤纸、一张PVDF膜、电泳凝胶及3张滤纸。将阴极放夹层上，根据凝胶面积按0.65 mA/cm2通电。完成后取凝胶，用考马斯亮蓝染色，检查蛋白转移情况。(3)将膜放入塑料盒中，加封闭液，室温下在摇床上慢慢摇动1～2 h，加入用封闭液1∶15稀释的 GM-CSF抗体(或 LMP2A抗体)，4℃轻摇2.5 h。弃去液体，用PBS洗膜3次，每次10 min。将膜移至 300 ml缓冲液［150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)］，室温下轻轻振荡 15 min。加入HRP标记的第二抗(用封闭液，不含叠氮钠，1∶500稀释)，室温轻轻振荡1.5 h。将膜放入350 ml缓冲液中，于室温下轻轻振荡，温育10 min，重复4次。将A液和B液各500 μl(ECL显色系统)混匀加至PVDF膜上，1.5 min后中止。用保鲜膜封好后，暗室内加X-光片曝光70 s。

1.2.4 LMP2A重组抗原免疫小鼠并检测外周血中抗体水平 将5周龄BALB/c雌性鼠随机分4组，每组10只，分2个免疫组，2个对照组:空腺病毒对照组和PBS组。用LMP2A重组抗原皮内注射免疫小鼠，每周1次，共3次。第1组:每只注射重组腺病毒5×108病毒颗粒/(100 μl/只);第2组:每只小鼠注射重组腺病毒5×107病毒颗粒/(100 μl/只);第3组:每小鼠注射未插入外源片段的腺病毒1×108病毒颗粒/(100 μl/只);第 4 组: 则注射 100 μl无菌PBS。免疫3次，间隔3周。免疫前、免疫后、加强免疫后每2周对小鼠尾部采血1次，至免疫后第21周止。采集外周血，分离、提取血清，用ELISA方法测抗体。包被抗原是本室制备的LMP2A重组抗原，2 μg/ml。96孔酶标板每孔0.5 μg LMP2A重组抗原孵育封闭，然后加鼠血清样品(不同稀释度)反应，与羊抗鼠 IgG抗体、羊抗鼠IgG2a抗体或羊抗鼠IgG1抗体孵育后，加底物四甲基联苯胺(3，3p，5，5p-Tetramethy lbenzidine，TMB)，2 mol/L硫酸溶液终止反应后用 Thermo Multiskan MK3酶标仪检测。

1.2.5 小鼠脾淋巴细胞CTL活性测定 分离小鼠脾淋巴细胞，用含3 μg/ml的 ConA、20 U/ml IL-2 的10%小牛血清RPMI1640细胞培养液重悬，37℃，5%CO2条件下培养2 d，MOI为1 000的重组腺病毒在500 μl RPMI1640中37℃感染120 min。将小鼠脾淋巴细胞继续培养48 h。收集细胞并用培养基洗2次，去除残存病毒，皮下注射免疫6～8周小鼠，野毒株及PBS作对照。第3和第5周各加强免疫1次，共免疫3次。第7周后处死取小鼠，取出脾脏，分离淋巴细胞，取培养24 h的各孔上清液100 μl，按照试剂盒所示方法用乳酸脱氢酶释放法检测各孔光密度值(A450值)，计算CTL对EBV阳性肿瘤细胞的杀伤率。

2 结果

2.1 GM-CSF和EB病毒LMP2A融合基因PCR产物的电泳分析结果 提取感染细胞总RNA，DNase l消化处理可能污染的DNA，RT-PCR检测GC2A融合基因的转录;同时以未感染重组腺病毒的CNE细胞RNA为模板作为对照，琼脂糖电泳分析可观察到约为1 961 bp大小的扩增片段，对照为阴性，表明融合基因在阳性胃癌细胞能有效转录(图1)。

图1 重组腺病毒的RT-PCR鉴定Fig.1 Identification ofrecombinantadenovirusby RT-PCR

2.2 EBV阳性胃癌细胞中重组腺病毒的表达用重组腺病毒感染EBV阳性胃癌细胞，重组腺病毒携带2个独立的CMV启动子表达盒，分别表达目的基因GC2A和GFP;48 h后在荧光显微镜下观察到EBV阳性胃癌细胞中GFP荧光，而对照胃癌细胞无荧光，可间接反映目的基因表达(图2)。

图2 48 h腺病毒感染后的EBV阳性胃癌细胞(×200)Fig.2 48 h EBV positive gastric cancer cells after adenovirus infection(×200)

2.3 感染vAd-GC2A的EBV阳性胃癌细胞GMCSF抗体和LMP2A基因的表达 从感染vAd-GC2A的EBV阳性胃癌细胞制备蛋白样品，经SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹法检测结果显示GM-CSF和LMP2A表达阳性，见图3。

2.4 重组腺病毒免疫小鼠外周血中抗体水平分析用1×108和5×107pfu重组腺病毒分别免疫小鼠，用ELISA方法检测在外周血中抗体水平及变化。如图4所示，当免疫抗原剂量低时，产生抗体量比较少，用高剂量重组腺病毒免疫时，抗体量增长比较快，抗体水平比较高。具体为，免疫前1周抽血，抗体滴度接近于0，免疫后1周抽血，最大剂量的抗体滴度为(64.8±8.4)pg/ml，次要剂量为(55.5±8.2)pg/ml，对照野毒株及PBS对照株接近于0，随着免疫时间的延长，重组腺病毒刺激机体产生的抗体增长较快，至免疫后第6周，最大剂量的抗体滴度达(184.5±8.7)pg/ml，次要剂量为(126±7.2)pg/ml，免疫后第7周抗体量不再增长，而2对照组不增长。最大剂量及次要剂量与对照野毒株和对照PBS相比，其差异具有显著性(P≤0.05)，而最大剂量与次要剂量之间的差异无显著性。

2.5 重组腺病毒免疫对小鼠脾淋巴细胞CTL活性的影响 本研究分重组腺病毒实验组、腺病毒5型野毒株及PBS对照组，每组6只小鼠。通过免疫小鼠，收集小鼠脾脏，分离脾细胞，用乳酸脱氢酶法检测结果显示，重组腺病毒免疫小鼠的CTL活性明显高于腺病毒和PBS免疫组，提示重组vAd-GC2A病毒感染小鼠的淋巴细胞，在小鼠体内起到呈递抗原的作用，并有效激发CTL反应(图5)。

乳酸脱氢酶释放法检测各孔光密度(A450)并计算平均值结果见表1，利用公式计算CTL对EBV阳性肿瘤细胞的杀伤率并统计学分析，结果表明，重组腺病毒对小鼠脾淋巴细胞CTL有明显的激活作用。不同刺激物诱导的CTL对EBV阳性肿瘤细胞的杀伤率，重组腺病毒实验组为(66.7±6.9)%，而腺病毒5型野毒株和PBS分别为(24.3±2.5)%和(32.4±3.1)%。其差异具有显著性(P≤0.05)。

图3 蛋白质印迹法检测GC2A基因的表达Fig.3 Detection of GC2A gene expression by Western blot

图4 重组腺病毒免疫小鼠后外周血中抗体水平观察Fig.4 Observation the level of antibody in peripheral blood of mice immunized with recombinant adenovirus

图5 重组腺病毒疫苗对脾淋巴细胞CTL活性影响Fig.5 Effect of recombinant adenovirus vaccine to spleen lymphocyte CTL activity

表1 乳酸脱氢酶释放法检测各孔光密度(A450)平均值Tab.1 Averageoptical density of lactate dehydrogenase release assay(A450)

3 讨论

EB病毒与很多肿瘤密切相关，其中大细胞淋巴瘤是免疫缺陷病人常发生的一种主要肿瘤。随着分子生物学的发展，用免疫方法来预防癌症的发生和转移以及作为预防治疗技术的有益补充，得到越来越多医疗工作者的重视［4］。GM-CSF(Gramulocyte/macrophase colony-stimulating factor，GM-CSF)由144aa组成、大小约为22 kD，其对树突状细胞(Dendritic cells，DC)调节作用非常强，能促进DC增殖与分化，维持DC细胞活力，并且对DC分布和抗原提呈有调节作用。将GM-CSF转移至肿瘤细胞可极大增强肿瘤细胞的免疫原性，提高人体抗肿瘤反应［5，6］。研究证实，在瘤体内注射能够表达GM-CSF基因的重组腺病毒可有效地诱导人体抗肿瘤免疫反应，增强抗肿瘤免疫的效果［7］。LMP2A基因编码的产物是一个很好的引发CTL反应的蛋白，国内外很多学者都在致力于由LMP2A引发的CTL来治疗EB病毒阳性肿瘤。LMP2A为EBV的表面潜伏膜蛋白基因，可刺激机体产生抗体［8，9］。Redchenko 等［10］用 LMP2A表位多肽负载DC，诱导出大量的特异性CTL，因此，LMP2A可成为EBV相关肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。如将LMP2A基因联合转入腺病毒表达载体，则可能表达两种抗原，使机体产生细胞免疫和体液免疫，预防和治疗EB病毒感染及杀伤EB病毒阳性肿瘤细胞。

腺病毒具有宿主广、易感染分裂期、静止期及终末分化期细胞的特点;用作基因工程的、能复制的缺陷腺病毒除具有上述特点之外，还具有很好的安全性［11］。向腺病毒中导入表达抗原的基因，被认为是一种很好的肿瘤疫苗发展策略。目前已有不少成功的先例［12］，这些研究结果显示，重组腺病毒能够引发强烈的细胞免疫，对肿瘤有一定的抑制作用。本研究结果表明，将基因GM-CSF和LMP2A进行融合，在体外构建重组腺病毒表达载体，可充分发挥LMP2A诱导特异性CTL的产生［13］和GM-CSF的免疫增强作用，进而协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞。

将融合基因GC2A作为外源性基因构建重组腺病毒载体后，用重组腺病毒转染EBV阳性的上皮性肿瘤细胞系，进一步深入研究融合基因GC2A通过联合激发机体免疫，共同杀伤肿瘤细胞的机制，为开展基因防治与治疗奠定基础。实验表明，当免疫抗原剂量低时，产生抗体量比较少，用高剂量重组腺病毒免疫时，抗体量增长比较快，抗体水平比较高。另外，重组vAd-GC2A病毒感染小鼠的淋巴细胞后，在小鼠体内起到呈递抗原的作用，并有效激发CTL反应。为进一步应用vAd-GC2A治疗或预防EB病毒相关肿瘤奠定了理论和实验基础。

［1］Chung GT，Lung RW，Hui AB，et al.Identification of a recurrent transformingUBR5-ZNF423 fusion gene in EBV-associated nasopharngeal carcinoma［J］.J Pathol，2013，22(10):4240-4247.

［2］Hoebe EK，Hutajulu SH，Van Beek J，et al.Purified hexameric Epstein-Barr virus-encoded BARF1 protein for measuring anti-BARF1 antibody responses in nasopharyngeal carcinoma patients［J］.Clin Vaccine Immunol，2011，18(2):298-304.

［3］薛庆节，吕厚东，梁卫平，等.GM-SCF与LMP2A融合基因重组腺病毒载体的构建与鉴定［J］.中华肿瘤防治杂志，2013，20(5):1675-1680.

［4］Xue Q，Wang H，Li X，et al.Construction and expression of prokaryotic expression vector containing EB virus gene Z2A［J］.Chinese journal of viral diseases，2011，1(4):201-206.

［5］Heather SLJ，Tim DB，Margaret BJ，et al.Granulocyte macrophage colony stimulating factor treatment is associated with improved cognition in cancer patients［J］.Brain Disord Ther，2012，1(1):172-178.

［6］孟冉冉，张跃伟，赵广生，等.树突状细胞肿瘤疫苗抗肿瘤研究进展［J］.中华肿瘤防治杂志，2012，19(20):1597-1600.

［7］Liang SC，Moskalenko M，Van Roey M，et al.Depletion of regulatory T cells by targeting folate receptor 4 enhances the potency of a GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapy［J］.Clin Immunol，2013，148(2):287-298.

［8］Shaojun L，Qiaojuan G，Jin L，et al.The initial results of Epstein Barr virus(EBV)-encoded latent membrane protein-1(LMP-1)for screening nasopharyngeal carcinoma(NPC) ［J］.Chin-Ger J Clini Oncol，2011，10(1):51-55.

［9］Portis T，Longneeker R.Epstein-Barr virus LMP2A interferes with g1obal transcription factor regulation when expressed during B-lymphoeyte develoPment［J］.J Virol，2008，77:105-114.

［10］Redchenko IV，Rickinson AB.Accessing Epstein-Barr virus specific T-cell memory with peptide loaded dendritic cells［J］.J Virol，1999，73:334-342.

［11］Wang YQ，Zhang HH，Liu CL，et al.Enhangcement of survivingspecific anti-tumor immunity by adenovirus prime protein-boost immunity strategy with DDA/MPL adjuvant in a murine melanoma model［J］.Int Immunopharmacol，2013，17(1):9-17.

［12］Peng W，Zhao G，Ma Y，et al.Dendritic cells transfected with PEG10 recombinant adenovirus elicit anti-tumor immune response in vitro and in vivo［J］.Vaccine，2011，29:3501-3506.

［13］王 湛，尉秀霞，周 玲，等.EB病毒LMP2-LMP1融合基因免疫效果的初步研究［J］.中国病毒病杂志，2011，1(1):45-50.