肉桂醛通过Hedgehog信号通路影响人肺腺癌A549细胞的E-cadherin、MMP-9的表达①

郑晓文 陈一强 孔晋亮 张剑锋 经庆玲(广西医科大学第一附属医院呼吸病研究所，南宁 530021)

肺癌发病率已居人类肿瘤首位，是肿瘤死亡的首要原因，化学治疗仍是目前主要治疗手段之一。传统化疗药物毒副作用大、易产生耐药性，导致治疗效果差。肉桂醛(Cinnamic aldehyde，CNMA)是一种FDA批准的常用食物香精的添加剂，有抗肿瘤、抗真菌、抗病毒作用，具有来源广泛、价廉、低毒副作用等优点［1］。已有多项研究表明小剂量肉桂醛在体外即可诱导细胞凋亡，直接抑制人黑色素瘤细胞、人肝癌细胞、结肠癌细胞等的增殖［2-4］。我们的前期实验发现小剂量肉桂醛作用肺腺癌A549细胞后其异常表达E-cadherin与MMP-9，并表现出增强的细胞迁移能力。Hedgehog信号通路是细胞分化增殖、组织分极的一种主要调节因子，Chen等［5］发现在肝癌细胞中 Hedgehog信号通路通过激活 MMP-2、MMP-9诱导肿瘤细胞的迁移和侵袭。本研究以不同浓度的肉桂醛作用于人肺腺癌A549细胞，并通过环巴胺阻断Hedgehog信号通路，探讨肉桂醛是否通过激活Hedgehog信号通路影响肺腺癌A549细胞的E-cadherin、MMP-9的表达，异常激活的Hedgehog信号通路是否与肉桂醛耐药性的形成密切相关。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料及相关试剂配制 人肺腺癌A549细胞株、人支气管上皮HBE细胞(中国科学院上海细胞库)，人E-cadherin及人MMP-9 ELISA试剂盒(武汉博士德生物公司);RPMI1640培养基、胎牛血清(Hyclone公司);肉桂醛、环巴胺及MTT(Sigma公司);逆转录试剂盒(大连宝生物);定量PCR试剂盒(Roche);E-cadherin单克隆抗体(Immunoway，YM0208);MMP-9单克隆抗体(Immunoway，YM0447)。原装肉桂醛溶液用DMSO溶解成浓度为1.048 g/ml的母液，用RPMI1640培养基稀释成200 μg/ml，按实验要求稀释成不同浓度。环巴胺(Cyclopamine)用DMSO配成20 nmol/ml，使用时用RPMI1640培养基稀释成不同的浓度。

1.1.2 Realtime-PCR引物序列 在NCBI gene bank查到相应的基因序列，采用Oligo5.0进行引物设计，然后在NCBI上进行primer blast，采用评分最高的引物序列。引物序列的合成由北京六合华大基因公司合成。见表1。

表1 引物序列及产物长度Tab.1 Primer sequences and products size

1.2 方法

1.2.1 MTT法测定肉桂醛及环巴胺对A549细胞增殖的影响 对数生长期A549细胞，0.25%胰酶消化，血清终止细胞消化，1 000 r/min离心5 min，细胞计数后，2.5×104ml－1的密度接种于 96 孔板，每孔加入200 μl，置入37℃、5%CO2孵箱培养。待细胞贴壁后分别加入 0、10、20、40 μg/ml的肉桂醛或0、1、2、5 nmol/ml的环巴胺。每组5 个复孔，置入孵箱继续培养，至24、48、72 h时，每孔分别加入5 mg/ml的 MTT溶液20 μl，继续孵箱培育4 h，吸尽上液后，每孔加入二甲基亚砜150 μl，避光振荡约10 min，酶标仪490 nm处测量吸光度OD值。

1.2.2 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 对数生长期的A549细胞以104ml－1的密度接种于6孔板，待细胞贴壁长满后，加入含20 μg/ml肉桂醛培养基，定期换液，待细胞长满后，用200 μl无菌枪头在孔底划线，用PBS冲去脱落的细胞，加入无血清培养基，分别在0、24 h拍照，用Image-pro plus测量细胞迁移的距离。

1.2.3 ELISA法测定细胞培养上清液中分泌性E-cadherin和 MMP-9的量 将 A549以104ml－1的密度接种于24孔板，贴壁后加或不加2 nmol/ml环巴胺，作用24 h 后弃上清，分别加入 0、10、20、40 μg/ml的肉桂醛溶液，均设5个复孔，在培养24、48、72 h后分别吸取培养基，分为空白组、环巴胺组、肉桂醛组、肉桂醛+环巴胺组，1 000 r/min离心5 min后取上清，－20℃保存。按ELISA试剂盒说明书稀释标准品，均设8个浓度梯度，并解冻保存的上清液样本至室温，按说明书进行操作，反应后酶标仪450 nm波长处测量吸光度OD值。

1.2.4 荧光定量PCR检测A549中Hedgehog信号通路主要成份及E-cadherin、MMP-9的mRNA水平的表达 荧光定量PCR检测人HBE和A549细胞中Hedgehog信号通路主要成份的表达 分为HBE组、A549 组、A549+肉桂醛(20 μg/ml)三组，检测 20 μg/ml肉桂醛作用前后的A549细胞和HBE细胞的SHH、PTCH1、SMO、GLI1 mRNA 表达。提取细胞总RNA，电泳判断总RNA的完整性，逆转录试剂盒获得cDNA，进行荧光定量PCR反应，反应体系20 μl［(Mix 10 μl，上游引物(10 μmol/L)0.6 μl，下游引物(10 μmol/L)0.6 μl，cDNA 1 μl，双蒸水 7.8 μl］。反应条件95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃ 1 min(40个循环)。60℃收集荧光。软件生成的标准曲线R2均大于0.99，扩增效率为90%～110%。按以上体系以及条件分别测定待测样本目的基因及内参的Ct值，2－△△Ct法计算基因表达的差异［注:2－△△Ct公式中:△△Ct=(Ct目的－Ct内参)待测样本－(Ct目的－Ct内参)参照样本］。

A549 E-cadherin和MMP-9的mRNA水平表达分为空白组，环巴胺组(2 nmol/ml)，肉桂醛组(20 μg/ml)，环巴胺+肉桂醛组(2 nmol/ml+20 μg/ml)，分别作用 A549细胞24、48 h。其具体检测方法同上。

1.2.5 蛋白免疫印迹法检测A549中E-cadherin、MMP-9蛋白的表达 常规提取20 μg/ml肉桂醛和/或2 nmol/ml环巴胺作用24 h的A549细胞总蛋白，SDS-PAGE，转膜 90 min，5%脱脂奶粉封闭 1 h，1∶5 000鼠抗人E-cadherin和1∶5 000兔抗人MMP-9室温孵育1 h，TBST洗膜3次，1∶6 000二抗孵育55 min，TBST洗膜3次，ECL显色，以β-actin作为内参照，用Quantity one图像分析软件进行灰度值分析。

1.3 统计学方法 使用SPSS16.0统计，计量资料以表示，组与组之间比较采用t检验，P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肉桂醛及环巴胺对A549细胞增殖的影响 10 μg/ml肉桂醛作用于A549细胞24 h时即可产生明显的抑制作用，随着浓度的增大抑制作用增大，不同浓度组之间以及各浓度组与对照组之间的抑制强度均具有统计学差异(P＜0.01)。随着作用时间增长，A549细胞增殖活性持续性降低，40 μg/ml的肉桂醛作用72 h后产生的增殖抑制率最高，为(93.782±5.036)%。环巴胺抑制A549的增殖，随着其浓度的增加，作用时间窗的延长，抑制的强度呈上升趋势，5 nmol/ml作用72 h抑制率为(40.539±4.923)%，不同浓度组之间以及各浓度组与对照组之间的抑制强度差异均具有统计学意义(P＜0.01)。增殖抑制率=(1－实验组OD值/对照组OD组)×100%。见表2、3。

表2 肉桂醛对A549细胞增殖的抑制率(%，)Tab.2 Inhibition rate of Cinnamic aldehyde on proliferation in A549 cell(%，)

表2 肉桂醛对A549细胞增殖的抑制率(%，)Tab.2 Inhibition rate of Cinnamic aldehyde on proliferation in A549 cell(%，)

Note:1)P＜0.01，compared to 0 μg/ml group;2)P＜0.01，compared to 10 μg/ml group;3)P＜0.01，compared to 20 μg/ml group.

Concentration(μg/ml)24 h 48 h 72 h 0 0 0 0 10 23.133±3.3971) 30.142±4.2481) 40.324±3.6231)20 45.307±5.1221)2) 52.097±4.7921)2) 60.031±5.7831)2)40 57.073±4.2431)2)3)79.098±6.2131)2)3)93.782±5.0361)2)3)

表3 环巴胺对A549细胞增殖的抑制率(%，)Tab.3 Inhibition rate of Cyclopamine on proliferation in A549 cell(%，)

表3 环巴胺对A549细胞增殖的抑制率(%，)Tab.3 Inhibition rate of Cyclopamine on proliferation in A549 cell(%，)

Note:1)P＜0.01，compared to 0 nmol/ml group;2)P＜0.01，compared to 1 nmol/ml group;3)P＜0.01，compared to 2 nmol/ml group.

Concentration(nmol/ml)24 h 48 h 72 h 0 0 0 0 1 11.627±2.4731) 18.647±2.5581) 21.471±3.1221)2 25.581±3.3671)2) 27.275±3.1651)2) 30.258±4.3651)2)5 34.883±3.8521)2)3)36.294±4.6371)2)3)40.539±3.9231)2)3)

2.2 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 经20 μg/ml肉桂醛作用后的A549细胞较空白组明显横向迁移能力增加(见图1)。空白组24 h相对迁移距离为38.523±16.627，肉桂醛组的相对迁移距离为164.121±43.294，二者移动的距离具有统计学差异(P=0.000 3)。

2.3 肉桂醛对A549细胞分泌性E-cadherin和MMP-9的表达的影响

2.3.1 肉桂醛对A549细胞分泌性E-cadherin表达的影响 不同浓度的肉桂醛作用于 A549，10、20、40 μg/ml的浓度均可以导致 E-cadherin的分泌呈下降 趋势，40μg/ml在72h分泌E-cadherin最少，为887.452 pg/ml，不同的浓度组24、48和72 h的 E-cadherin分泌量差异具有统计学意义(P＜0.05，表4)。与空白组相比较，E-cadherin的分泌量在环巴胺组增多，在肉桂醛组则是分泌量减少，环巴胺和肉桂醛联合组分泌量增多，分泌量的差异在各组之间相比较均有统计学差异(P＜0.05);在24、48、72 h三个时间呈现同一趋势(图2A)。

2.3.2 肉桂醛对A549细胞分泌性MMP-9表达的影响 肉桂醛作用于 A549，10、20、40 μg/ml组均导致MMP-9的分泌量上升，40 μg/ml在72 h分泌MMP-9最多，为1 863.470 pg/ml，不同的浓度组在各个时间的MMP-9的分泌量相比较均具有统计学差异(P＜0.05，表4)。与空白组相比较，MMP-9的分泌在环巴胺组减少，肉桂醛组则是分泌增加，二者联合后分泌减少，分泌量的差异在各组之间相比较均有统计学差异(P＜0.05);在24、48、72 h三个时间呈现同一趋势(图2)。

2.4 Hedgehog信号通路主要成份在A549中的表达 Hedgehog信号通路4种主要成份SHH、PTCH1、SMO、GLI1的mRNA相对表达量在A549中的表达明显高于HBE细胞，20 μg/ml肉桂醛作用后A549的各成份mRNA相对表达量增加，HBE、A549及肉桂醛组的各成份mRNA表达均具有统计学差异(P＜0.05)。见图3。

2.5 肉桂醛作用A549细胞后E-cadherin和MMP-9的mRNA的相对表达量的变化 环巴胺组及环巴胺+肉桂醛组的E-cadherin mRNA表达与空白组相比较均呈上升趋势，而肉桂醛组呈下降趋势。肉桂醛组的E-cadherin mRNA表达高于联合组，差异有统计学意义(P＜0.05)。各组E-cadherin mRNA 24 h与48 h的表达量无统计学差异(P＞0.05)。见图4A。

MMP-9 mRNA的表达在环巴胺组呈下降趋势，在肉桂醛及联合组呈现上升趋势，环巴胺组相对表达量最高，与其余各组差异显著(P＜0.05)，联合组的表达明显高于肉桂醛组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。各组MMP-9 mRNA的相对表达24 h与48 h之间无统计学差异(P＞0.05)见图4B。肉桂醛组的E-Cadherin和MMP-9的mRNA的相对表达量24 h相关系数R2=－0.995 5，48 h相关系数R2=－0.977。

2.6 蛋白免疫印迹法检测A549细胞E-cadherin和MMP-9蛋白水平表达 肉桂醛作用A549细胞后E-cadherin蛋白水平表达量相对减少，而作用于已被环巴胺预处理的A549细胞，其E-cadherin蛋白相对表达量与肉桂醛组相比差异具有统计学意义(P=0.019 7)。MMP-9蛋白的相对表达量在肉桂醛组最高，环巴胺+肉桂醛组最低，二者差异具有统计学意义(P=0.001 4)。见图5。

图1 肉桂醛对A549细胞迁移的影响(×200)Fig.1 Effect of Cinnamic aldehyde on A549 cell migration(×200)

表4 肉桂醛作用于A549后分泌性E-cadherin和MMP-9的表达Tab.4 Expression of E-cadherin and MMP-9 on A549 with Cinnamic aldehyde detected by ELISA

图2 ELISA检测E-cadherin和MMP-9在不同组中表达Fig.2 E-cadherin and MMP-9 expression in different groups detected by ELISA

图4 肉桂醛对A549的E-cadherin和MMP-9 mRNA表达的影响Fig.4 E-cadherin and MMP-9 mRNA expression on A549 co-cultured with Cinnamic aldehyde

3 讨论

图3 Hedgehog信号通路成份在不同组中的mRNA表达Fig.3 mRNA expression of Hedgehog signal transduction pathway members on different groups

图5 肉桂醛对A549细胞E-cadherin和MMP-9蛋白水平表达的影响Fig.5 Expression of E-cadherin and MMP-9 protein in A549 co-cultured with Cinnamic aldehyde

肺癌是一种严重威胁人类健康的疾病。肿瘤药物生物综合治疗中的耐药形成会造成肿瘤的复发和转移，降低治疗的有效性。如何提高目前肿瘤药物治疗的特异性，减少机体不良反应，避免耐药性的形成等仍是肿瘤生物综合治疗的研究重点。寻找新的安全有效的可替代传统药物的化疗药物也一直是研究热点。

本研究发现小剂量的肉桂醛即可以明显抑制细胞的增殖，并且随着浓度的增大、作用时间的延长，抑制率随之增加。已有多项研究表明小剂量肉桂醛在体外即可诱导细胞凋亡，直接抑制人黑色素瘤细胞、人肝癌细胞、结肠癌细胞等的增殖，而达到抗肿瘤的作用。有关肉桂醛抗肿瘤的具体机制的相关研究表明:肉桂醛可以诱导人肝癌PLC/PRF/5细胞凋亡，其靶向凋亡主要通过线粒体途径，用维生素E预处理细胞可以显著抑制肉桂醛介导的凋亡，该机制可能与 XIAP、cIAP-1、cIAP-2、Bcl-2 和 Bax蛋白活性调节相关［4］。Toshio 等［6］发现在转基因小鼠CB6F1-TgHras2(rasH2)的致癌性实验中，服用肉桂醛后在雄性小鼠中可显著减少甲基亚硝氨基吡啶NNK诱发的肺肿瘤的发生率和降低肿瘤的基因多态性。Audrey等［2］发现用最小毒性浓度的肉桂醛作用于结肠癌HCT细胞4～6 h即可以诱导明显的DNA损害，并削弱 DNA修复重组，减少自发性突变。

肉桂醛抗肿瘤的作用是非常明确的，但目前尚未有关于肉桂醛耐药的报道。本实验结果显示在细胞划痕实验中，肉桂醛作用后的细胞表现出较强的迁移能力，并且在细胞水平伴随E-cadherin表达的减低和 MMP-9表达的上升，提示肉桂醛作用于A549细胞后，引起细胞适应性变化，异常表达某些基因或某些通路的异常表达，导致增强的迁移、侵袭能力。这是不是提示肉桂醛短时间作用下细胞会产生适应性的变化，来抵抗机体的肿瘤免疫清除作用?如果在肉桂醛作用下A549细胞产生了适应性的变化，又是通过何种途径来实现的呢?既往研究表明，肿瘤的迁移和侵袭过程中E-cadherin和MMPs中发挥重要的作用，多种调控机制参与这个过程。E-cadherin是一种重要的阻止肿瘤细胞离开原发病灶的肿瘤转移抑制因子［7］。在人肺腺癌细胞系A549中，通过下调 E-钙黏素并且上调纤维连接蛋白、MMP-2、连接组织生长子和胶原，诱导EMT，使得细胞-细胞接触减少，最终导致细胞的延伸［8］。激素非依赖的PC-3细胞稳定转染表达WIF-1导致更多的细胞间连接形成的形态学改变，显示弱侵袭的肿瘤表型，这种形态学的改变伴随着显著减少的E-cadherin表达［9］。E-cadherin的表达上调、MMP-2 和MMP-9的活性和表达下调抑制雄激素非依赖的PC-3细胞的体外侵袭和肿瘤生长［9］。

Hedgehog(Hh)信号通路调节细胞的增殖、分化，并在胚胎发育期起关键作用，协调组织器官如皮肤、脑、神经管、肠及肺等发育过程中的关键步骤，在成年期，调节干细胞及早期祖细胞微环境［10］。SHH还影响细胞的命运，促进其增殖、抑制神经细胞的分化和调控血管直径加粗、变长和分叉，影响基质细胞分泌众多新生血管因子［11］。致病性HH活动已在多种人肿瘤中被描述，包括胰腺癌、结肠癌、转移性前列腺癌和胶质母细胞瘤、恶性黑色素瘤［12-15］。本研究表明 Hedgehog信号通路主要成份 SHH、PTCH1、SMO、GLI1在A549细胞中的表达明显高于肺上皮细胞HBE，肉桂醛作用前后的A549细胞的Hedgehog信号通路各成份的表达具有统计学差异，提示肺腺癌A549细胞中有异常激活的Hedgehog信号通路，而肉桂醛的作用可进一步刺激其信号通路转导。当使用Hedgehog信号通路抑制剂环巴胺，在1 nmol/ml即可以逆转肉桂醛导致的E-cadherin表达下调及MMP-9表达增高，表现为E-cadherin表达上调及 MMP-9表达下调，表明肉桂醛可能通过Hedgehog信号通路的异常激活来调控E-cadherin和MMP-9的表达，并且这种激活是浓度依赖式的。

我们的研究表明，肉桂醛直接抑制人肺腺癌A549细胞，但小剂量肉桂醛作用A549细胞后，细胞表现出增加的迁移能力，E-cadherin表达下调及MMP-9表达增高，与异常激活的Hedgehog信号通路相关。与既往肿瘤化疗药物治疗中出现的情形一致，肿瘤细胞化疗药物作用后产生了一些适应性的变化或者是肿瘤细胞中一些具有更强抗药性的细胞残存了下来，是不是验证了所谓“肿瘤起始细胞”或称之为肿瘤干细胞的存在?而后者常常是肿瘤转移和治疗后复发的根源所在［16］。肉桂醛有明确的抗肿瘤作用，但是小剂量短时间即可使A549细胞产生了一定的耐药性，表现为E-cadherin表达下调及MMP-9表达增高，异常激活的Hedgehog信号通路可能是其主要原因之一。

综上，肉桂醛可以联合Hedgehog信号通路抑制剂治疗人类肺腺癌获得良好的治疗效果，但探索适宜的作用浓度、最佳作用时间，联合特定生物靶向剂，提高治疗的特异性，减少耐药性的形成等仍是研究肉桂醛抗肿瘤机制的重点方向。

［1］Hayashi K，Lmanishi N，Kashiwayama Y，et al.Inhibitory effect of cinnamaldehyde，derived from Cinnamomi cortex，on the growth of influenza A/PR/8 virus in vitro and in vivo［J］.Antiviral Res，2007，74(1):1-8.

［2］King AA，Shauqhnessy DT，Mure K，et al.Antimutagenicity of cinnamaldehyde and vanillin in human cells:Global gene expression and possible role of DNA damage and repair［J］.Mutat Res，2007，616(1-2):60-69.

［3］周 凌，鲁元刚，杨红佳.肉桂醛对恶性黑色素瘤A375细胞增殖和分泌VEGF的影响［J］.第三军医大学学报，2012，34(7):602-604.

［4］Wu SJ，Ng LT，Lin CC.Effects of vitamin E on the cinnamaldehyde induced apoptotic mechanism in human PLC/PRF/5 cells［J］.Clini Exp Pharmacol Physiol，2004，31(11):770-776.

［5］Chen JS，Huang XH，Wang Q，et al.sonic hedgehog signaling pat hway induces cell migration and invasion through focal adhesion kinase/AKT signaling-mediated activation of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 in liver cancer［J］.Carciogenesis，2013，34(1):10-19.

［6］Imai T，Yasuhara K，Tamura T，et al.Inhibitory effects of cinn-amaldehyde on 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanoneinduced lung carcinogenesis in rasH2 mice［J］.Cancer Letters，2002，175(1):9-16.

［7］龙方懿，印国宾，刘智敏，等，HIF-α、MT、Slug和 E-cadherin在人乳腺癌中的表达及其意义［J］.中国免疫学杂志，2012，28(6):502-506.

［8］Kasai H，Allen JT，Mason RM，et al.TGF-beta1 induces human alv-eolar epithelial to mesenchymal cell transition(EMT)［J］.Respir Res，2005，6:56.

［9］Zi XL，Guo Y.Up-regulates expression of E-cadherin and downregulates activities and expression MMP-2 and 9，leading to inhibition of in vitro invasiveness and tumor growth of androgen-independent PC-3 cells［J］.Proc Amer Assoc Cancer Res，2005，46:312-314.

［10］Beachy PA，Karhadkar SS，Berman DM.Tissue repair and stem cell renewal in carcinogenesis［J］.Nature，2004，432(7015):324-331.

［11］Yoo YA，Kang MH，Lee HJ，et al.Sonic hedgehog pathway promotes metastasis and lymphangiogenesis via activation of Akt，EMT，and MMP-9 pathway in gastric cancer［J］.Cancer Res，2011，71(22):7061-7070.

［12］Datta S，Datta MW.Sonic Hedgehog signaling in advanced prostate cancer［J］.Cell Mol Life Sci，2006，63(4):435-448.

［13］Gulino A，Ferretti E，De Smaele E.Hedgehog signalling in colon can cer and stem cells［J］.EMBO Mol Med，2009，1(6-7):300-302.

［14］Samarzija I，Beard P.Hedgehog pathway regulators influence cervical cancer cell proliferation，survival and migration［J］.Biochemi Biophysical Res Communi，2012，425(1):64-69.

［15］Plaisant，M，Giorgetti-Peraldi S，Gabrielson M，et al.Inhibition of hedgehog signaling decreases proliferation and clonogenicity of human mesenchymalstem cells［J］.PloS One，2011，6(2):e16798.

［16］Michor F，Huqhes TP，Iwasa Y，et al.Dynamics of chronic myeloid leukaemia［J］.Nature，2005，435(7046):1267-1270.