脐带间充质干细胞移植对类风湿性关节炎患者相关炎性因子影响的探讨①

王黎明 王立华 李 铭 白 雯 钟占强 石 军 周建军 王倩云 吉海杰 吴明远刘拥军④(解放军323医院生物诊疗中心，西安 710054)

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一主要累及周围关节的自身免疫性疾病，其特征性病变为关节滑膜炎［1］。患者体内免疫细胞过度的活化分泌了大量的炎性因子和趋化因子，在RA关节局部的炎症发展和全身的免疫反应中起关键性作用。TNF-α和IL-1的抑制剂对RA的治疗取得良好的疗效，由此表明炎性反应参与了RA的发生和发展，然而存在着疾病复发及增加感染的几率，且对受损的组织细胞无修复作用。近年来间充质干细胞(MSCs)基础研究显示，通过抑制过度活化的免疫细胞增殖、调节有关细胞因子可以缓解胶原诱导的关节炎的炎症［2］。研究发现，MSCs能够通过趋化因子迁移到受损组织细胞，抑制促炎症因子(Pro-inflammatory factor)的释放，修复受损细胞，并且能够诱导外周免疫耐受治疗多种自身免疫性疾病［3］。但是，目前针对MSCs治疗RA的机制尚无系统报道。我们前期研究发现MSCs治疗有助于RA患者临床症状的改善且安全性好［4］。因此为了进一步研究MSCs治疗RA的作用机制，现将94例RA患者应用脐带间充质干细胞(UC-MSCs)治疗前、后免疫细胞分泌的相关炎性因子变化进行探讨，具体报告如下。

1 资料与方法

1.1 资料 自2011年4月至2012年12月在我科住院应用UC-MSC治疗的94例RA患者，男10例，女84例，年龄17～70岁，病程1.5～40年;94例患者符合1987年美国风湿病学会提出的RA分类标准。94例接受了1次UC-MSCs治疗，其中60例接受了2次UC-MSCs治疗。全部患者长期不规律使用非甾体抗炎药(NSAIDs)、改善病情抗风湿药(DMARDs)及糖皮质激素、中药等药物治疗，病情控制不佳。94例患者均有不同程度的多关节疼痛，疼痛关节数＞3个，晨僵＞1 h，伴有多个指间和指掌关节肿胀，22例患者伴有指关节畸形，呈尺偏和/或“鹅颈”样改变。22例患者ESR在20～40 mm/h之间，34例在40～80 mm/h之间，32例ESR＞80 mm/h，6例血沉正常;22例患者CRP在10～40 mg/L之间，39例在40～80 mg/L之间;23例＞80 mg/L，10例CRP正常;86例患者类风湿因子阳性，检测ANA谱中14例患者SSA-52抗体阳性(+～+++)、23例患者SSA-60抗体阳性(+～+++)，5例SS-B抗体阳性(+～+++);抗CCP抗体阳性88例，X线Larsen评分Ⅰ级34例，Ⅱ级37例，Ⅲ-Ⅳ级22例，正常1例。4例患者胸片提示有不同程度的肺间质增生。所有患者细胞治疗前经院伦理委员会批准，患者知情同意并签字。

1.2 方法

1.2.1 实验室检测 患者外周血中细胞因子水平检测:用促凝管收集RA患者外周血，静置30 min后，3 500 r/min，5 min离心，取出血清后分装于0.6 ml EP管中，每管200 μl，－80℃保存以备检测。用Milliplex多因子检测试剂盒(Human Cytokine/Chemokine Panel I，TGF1 single plex kit)检测血清中 TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12(p40)、IL-15、IL-17、RANTES、TGF-β、TNF-β、lymphotactin 的 13种因子含量，多功能流式点阵仪Luminex 200分析检测。以上项目均由和泽科技生物有限公司实验室提供。CRP、自身抗体水平、抗CCP抗体、血沉、肝功、肾功、血脂检测在我院实验室检测。

1.2.2 脐带间充质干细胞采集及制备 脐带间充质干细胞由天津协和国家干细胞脐血库提供，制备过程［5］:采集新生儿脐带，将脐带剪碎至约1 mm×1mm×1 mm，经0.1%胶原酶和0.125%的胰酶37℃消化30 min，先后用100目及200目滤网过滤，去除未消化的组织。过滤后的细胞按1×106/cm2接种于塑料培养瓶，用含 DMEM-LG/F12(Sigma，USA)，5%FCS(Gibco BRL，USA)的培养基，置37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养，4～5 d后换液，弃非贴壁细胞，以后每3～4 d半量换液。待细胞80%融合，0.25%胰酶(Sigma，USA)消化，按1×104/cm2传代。贴壁细胞常规消化后，以FITC标记的CD105(SH2)、CD44抗体及其相应同型对照标记细胞，流式细胞仪(FACA Calibur型，USA)检测。获得(1.0～5.6)×107的脐带间充质干细胞，流式细胞仪检测阳性率为80%。

1.2.3 治疗方法 94例患者均直接将细胞数为4×107的UC-MSC40ml静脉输注，其中57例患者行2次细胞治疗。

1.3 疗效评估标准

1.3.1 临床疗效评估 28个关节的疾病活动度评分(DAS28)［6］DAS28≤2.6分提示病情处于缓解期;2.6～3.2分之间提示病情处于低活动度;3.2～5.1分之间提示病情为中活动度;＞5.1分提示病情为高活动度;健康评定量表(HAQ)［7］。

1.3.2 实验室疗效评估 CRP、ESR、相关炎性因子(TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12(p40)、IL-15、IL-17、RANTES、TGF-β)。

1.4 随访观察 随访时间:按细胞治疗前及治疗后1周、3个月、6个月。

1.5 安全性评估 每次随访记录患者的不良反应，定期检查肝肾功能、心电图、X线胸片、血压等指标以观察其不良反应及其转归情况。不适反应分级为:0.无不适;1.轻度不适，未影响日常生活;2.中度不适，影响日常生活和工作;3.中度不适，明显影响生活，卧床休息;4.重度不适，危及生命。

1.6 统计学分析 所有数据统计学分析均采用SPSS17.0软件程序进行t-配对检验分析，无统计学意义(P＞0.05)。

2 结果

2.1 有效性评估 94例患者，随访1周、3个月(第1次细胞治疗后，观察到3个月)、6个月(94例中53例第1次细胞治疗后的3个月进行第2次细胞治疗，观察到6个月)，全部患者在饮食、睡眠、体力、疲劳等方面均有明显改善;按美国风湿病协会(ARA)制定的类风湿性关节炎疗效评估标准，治疗后3个月77.6%患者满足ARA20标准，多关节疼痛、肿胀、压痛明显缓解，疼痛、肿胀的关节数减少，关节活动度增加，晨僵＜1 h;73例患者DAS28＜3.2;18例患者DAS28在3.2～5.1分之间，3例DAS28 ＞5.1分;按DAS28评分标准、HAQ评分标准(参见图1)，3个月、6个月较治疗前逐渐下降，均具有统计学意义(P＜0.01)，2次治疗较1次治疗继续下降，具有统计学意义(P＜0.01);ESR、CRP(参见图2)在治疗后1周显著下降，具有统计学意义(P＜0.01)，3个月、6个月较治疗前也有下降，均具有统计学意义(P＜0.05)。复查患者手X线片无明显变化。

2.2 相关因子检测 IL-6、TNF-α治疗后1周、3个月、6个月进行检测，均呈下降水平，均具有统计学意义(P＜0.05);IL-8治疗后1周出现升高现象，随之在3个月时较治疗前下降、在6个月时明显下降，具有统计学意义(P＜0.05)。

图1 患者治疗前、后3个月、6个月DAS28、HAQ评分图Fig.1 HAQ and DAS28 of RA patients tested in different times

2.3 安全性评估 不适反应分级为:0.无不适;1.轻度不适，未影响日常生活;2.中度不适，影响日常生活和工作;3.中度不适，明显影响生活，卧床休息;4.重度不适，危及生命。94例患者安全性评估与我们前期研究相同，无患者出现各级反应;94例患者在治疗前及随访的3、6个月进行了血常规、肝肾功能、血脂检测均在正常范围内，未见异常［4］。

图2 患者治疗前、后1周、3个月、6个月 CRP、ESR变化图Fig.2 CRP and ESR of RA patients tested in different times

图3 患者治疗前、后1周、3个月、6个月IL-6、TNF-α变化图Fig.3 IL-6 and TNF-α of RA patients tested in different times

图4 患者治疗前、后1周、3个月、6个月IL-8变化图Fig.4 IL-8 of RA patients tested in different times

3 讨论

RA存在着促炎细胞因子和抑炎细胞因子的失衡，从而导致自身免疫疾病的产生、慢性炎症及关节损害。T辅助细胞(Th)在RA中主要是通过分泌细胞因子起作用，但各亚型所分泌的细胞因子不同，他们在复杂的调控网络中起的作用不同，有研究显示RA患者的关节炎症反应与CD4+T细胞的大量浸润有关，Th1细胞所分泌的细胞因子如IL-1、TNF-α、IFN-α等。TNF-α起促炎作用，参与RA发生和发展的过程。TNF-α诱导内皮细胞表达黏附分子(如ICAM-1)，促进白细胞和血管内皮的黏附渗透，导致局部炎症，同时增加滑膜及内皮细胞成纤维细胞生长因子的释放而促进了血管翳的形成，另外还可促使滑膜细胞、巨噬细胞、纤维母细胞和软骨细胞产生IL-1、IL-8及其本身来加重组织损伤。IL-6和趋化因子如IL-8对诱发炎症反应起着重要作用［8］。IL-6是RA关节炎症中的主要炎性介质，在RA的发病机制中起着促炎作用，也参与RA发生、发展的过程。在RA中IL-6的致病作用是直接刺激滑膜母细胞和软骨细胞产生前列腺环素E2和胶原酶，增强了IL-1、TNF-α的效应，并诱导其他细胞因子IL-1、IL-2、TNF-α 产生并发挥致病作用［9］。我们的研究结果证实了RA患者体内TNF-α、IL-6明显增高，说明RA患者存在着慢性炎症反应。传统非甾体类抗炎药物(NSADs)和慢作用抗风湿药(SAARDs)由于诸多因素并不能完全缓解病情，使RA不断进展，甚至致残。近年来随着生物细胞技术的发展，许多研究证实MSCs在体内外可以分化为成骨、软骨、脂肪、腱、肌肉等细胞［10］，可能参与受损组织的再生修复;关节病变可以促进MSCs向病变滑膜聚集，从而修复损伤的关节组织［11］。MSCs加入到有丝分裂原刺激的外周血淋巴细胞培养体系中，均能明显抑制T淋巴细胞的增殖活化，同时MSCs具有趋化作用，可以阻止炎性介质的释放，减轻炎症反应，减轻组织损伤，有利于阻止病情进展［12］。然而，RA患者自身的MSCs不能像正常人的MSCs一样具有较高的克隆和增殖能力［13］，因此，我们可以通过应用异源性MSCs来治疗以上患者，达到临床症状改善的目的。常见MSCs有两种来源:骨髓和脐带，而后者更易获得，同时具有分化能力高、免疫原性低等优势［14］，本文的研究选择了UC-MSCs。通过我们对本组RA患者输注UC-MSCs前后相关炎性因子的检测结果显示，IL-6、TNF-α治疗后 1周、3个月、6个月均呈下降水平(P＜0.05);有趣的是IL-8治疗后1周出现升高现象，随之在3个月时较治疗前下降、在6个月时明显下降(P＜0.05)，这是否说明IL-8参与对炎性因子的趋化(IL-6、TNF-α)作用还需进一步证实。同时经过细胞治疗的RA患者ESR、CRP指标的下降(P＜0.05)，及 DAS28、HAQ评分的降低(P＜0.05)、治疗后3个月77.6%患者满足 ARA20标准，进一步证明了炎性因子下调与RA患者临床指标及症状的缓解直接相关。通过对53例2次输注U-MSCs患者6个月炎性因子、临床指标的检测，仍保持在一个稳定水平，并有继续下降的趋势。94例患者其他炎性因子(IL-17、IL-4、IL-10等)也有一些变化，但未找到规律性的变化，仍需进一步观察探讨。

本研究表明，对传统药物治疗反应欠佳的活动性类风湿性关节炎患者而言，hUC-MSCs治疗可以长期、安全有效地降低疾病活动性，并且无毒副作用。UC-MSCs可能通过降低外周血炎性因子及趋化因子的浓度来改善临床症状，提示hUC-MSCs有抗炎、免疫调节作用。RA患者的病损关节中，TNF-α、IL-1和IL-6［15-18］水平升高，提示其可能参与了疾病的发生发展［17］。众所周知，滑膜细胞分泌的细胞因子增多是类风湿性关节炎发病机制之一［19］。而MSCs可以表达多种炎性因子的受体，从而可以结合炎性因子来有效降低RA患者的炎症反应［14］。UCMSCs治疗后，患者血清TNF-α、IL-6和CRP水平显著性降低，表明抗炎作用或许是UC-MSCs治疗类风湿性关节炎的机制之一。

综上所述，UC-MSCs可以安全有效地治疗活动性类风湿性关节炎，显著改善了所有患者的临床症状，提高了生活质量，阻止病情进展。首次治疗后疗效可以维持3个月以上，二次治疗可以进一步巩固首次治疗效果。UC-MSCs可能成为临床治疗类风湿性关节炎的新选择。

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