MicroRNA-150通过降低CD122的表达调控NK及NKT细胞的分化①

张爱红 郑全辉 郑建兴 李 娟 侯志宏 刘亚楠 张庆波

(唐山市工人医院，唐山 063000)

MicroRNAs(miRNAs)属于短链非编码RNAs，长度为20～23 nt，通过与靶mRNA 3'端非翻译区结合，导致靶mRNA的降解或抑制其翻译，负向调节靶基因的表达［1］。近来研究表明，众多miRNAs在免疫系统中呈细胞类型和发育阶段的特异性表达，并在调控多种适应性和固有免疫细胞的发育和功能中发挥作用［2，3］。miRNA合成关键酶Dicer敲除导致胸腺传统T细胞、调节性T细胞(Treg)、NK、自然杀伤性T细胞(NKT)发育受阻，数量减少［4-7］。

但特异miRNAs在以上细胞中的作用并不十分清楚。有意思的是，尽管Dicer缺失对于B细胞、DC和巨噬细胞的发育和成熟影响不大，某些特异miRNAs的缺失或表达异常却显著影响以上细胞的发育和功能发挥［7-10］。因此，特异miRNA在某些免疫细胞的发育、成熟和功能的调控中可能扮演重要角色。

MicroRNA-150(miR-150)广泛表达于机体多种免疫细胞，Zhou等［8］发现miR-150缺失致B细胞异常扩增，体液免疫应答显著增强。我们近期研究结果表明，miR-150缺失不影响传统αβT细胞的产生和发育，但导致NKT细胞发育阻止在终末成熟阶段［11］。在此研究中，我们进一步探讨了miR-150缺失对调节性T细胞(Treg)、γδT、NK及NKT细胞产生和自稳的影响，发现miR-150缺失对Treg和γδT细胞的产生不发挥明显作用，但导致NK和胸腺NKT细胞的数量显著降低，miR-150缺失导致小鼠NK及NKT细胞中CD122的表达显著降低，细胞发育受阻，凋亡增加，同时NK细胞的增殖能力显著降低。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠 C57BL/6背景的miR-150基因敲除小鼠(miR-150KO)和野生型对照 C57BL/6小鼠(WT)由Qing-Sheng Mi博士(美国密歇根州亨利福特医院)惠赠，并在河北联合大学SPF级小鼠房繁殖、饲养。实验选取4～6周龄、性别匹配小鼠进行研究。小鼠实验操作按河北联合大学实验动物管理委员会规定进行。miR-150敲除小鼠基因型鉴定采用下列引物:上游:5-CAAGGACAGGAACCCTTCAGCA-3;下游5-CCATGATGCCTGGAAGACATTTC-3，miR-150KO小鼠产生262 bp片段，WT小鼠产生866 bp片段。

1.1.2 试剂 miRVana miRNA提取试剂盒和Taq-Man MicroRNA检测试剂盒购自美国Ambion公司，荧光素标记的α-Galcer/CD1d四聚体购自日本麒麟公司。荧光素标记的抗小鼠 TCR-β(H57-597)、抗CD4(RM4-5)，抗 CD25(PC61)，抗 γδTCR(11F2)，抗NK1.1(PK136)，抗 CD122(5H4)，抗 Brdu 抗体，抗Foxp3(FJK-16s)抗体及胞内染色试剂盒，以及Annexin V染色试剂盒购自BD或eBioscience公司，Brdu购自Sigma公司。大鼠抗小鼠FcR单克隆抗体(2.4G2)取自2.4G2杂交瘤细胞培养上清，引物由上海生物工程服务公司合成。

1.2 方法

1.2.1 实时定量RT-PCR 提取细胞总RNA，采用TaqMan MicroRNA检测试剂盒进行反转录和PCR扩增，以snoRNU202作为内参照。PCR扩增产物检测采用ABI 7900 Real-Time PCR system进行，结果分析采用Log2值，并计算相对表达。

1.2.2 流式细胞仪分析 分离小鼠胸腺和脾脏并制成单细胞悬液，用含2%小牛血清的PBS染色缓冲液洗涤两次，加入2.4G2封闭，4℃ 30 min，然后直接加入适当浓度荧光素标记的单克隆抗体，4℃ 30 min。染色缓冲液洗涤两次，采用BD-LSRⅡ流式细胞仪收集标本，CellQuest Pro(BD Biosciences)软件进行数据分析。细胞凋亡分析采用Annexin V染色试剂盒，按说明书操作，数据分析同上。

1.2.3 细胞内染色 胸腺及脾脏淋巴细胞首先进行如上细胞表面染色，4℃ 30 min，染色缓冲液洗涤两次，加入1∶3混合的Fixation/Permeabilization缓冲液。4℃固定、打孔60 min，采用透膜缓冲液洗涤两次，加入抗Foxp3抗体，4℃ 30 min，染色缓冲液洗涤两次后上机检测。

1.2.4 Brdu掺入法检测细胞增殖 小鼠每24 h腹腔注射Brdu 1 mg/小鼠，连续注射3 d。小鼠处死后收集胸腺和脾脏细胞，首先进行细胞表面染色，4℃30 min。细胞经固定、透膜后加入DNase I(100 μg/ml)，37℃，1 h，加入荧光素标记抗Brdu单克隆抗体染色，流式细胞仪分析同上。

1.3 统计学分析 采用GraphPad Prism v5.0软件，进行数据处理和统计分析，结果采用双尾Student's t检验，P＜0.05为组间有统计学差异。

2 结果

2.1 miR-150敲除不影响调节性T细胞(Treg)和γδT细胞的产生 采用loxP-Cre酶系统制备miR-150基因敲除小鼠。基因鉴定miR-150敲除小鼠产生262 bp的DNA扩增片段，而野生型小鼠产生866 bp的DNA扩增片段(图1A)。Real-time PCR结果显示，与正常对照组小鼠(WT)相比，miR-150基因敲除小鼠(150KO)中miR-150的表达显著降低(图1B)。分离WT正常对照和miR-150基因敲除小鼠胸腺和脾脏细胞，采用抗小鼠 CD4、CD25和抗Foxp3抗体染色，观察miR-150敲除对小鼠CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)产生的影响，发现miR-150缺失不影响胸腺和外周Treg细胞的产生(图1C、D)。同时，抗小鼠γδTCR抗体染色结果显示，miR-150缺失也不影响胸腺和外周γδT细胞的产生(图1E、F)。

2.2 miR-150敲除致NK和胸腺NKT细胞数量减少 NK和NKT细胞是两类重要的固有免疫细胞，二者在表型和功能上均存在诸多相似之处［12］。采用抗TCRβ和NK1.1抗体染色检测胸腺和脾脏NK细胞，以及联合 α-GalCer/CD1d四聚体染色检测NKT细胞的产生。发现与WT小鼠相比，miR-150敲除小鼠胸腺和脾脏NK细胞的比例和数量均显著降低(图2A～C)。NKT细胞的数量在miR-150敲除小鼠胸腺中也显著降低。而与WT小鼠相比，NKT细胞在miR-150敲除小鼠脾脏中没有显著变化(图2D～F)。

2.3 miR-150敲除致MK和胸腺NKT细胞CD122表达降低 NK1.1和CD122在小鼠NK和NKT细胞发育、成熟过程中表达增加，是NK及NKT细胞发育过程中的特异性标志分子［13］。检测miR-150敲除小鼠NK及NKT细胞中NK1.1和CD122的表达变化。发现与WT对照组小鼠相比，miR-150敲除小鼠NK细胞中NK1.1和CD122的表达阳性率显著降低(图2A，图3B);同时，miR-150敲除小鼠胸腺NKT细胞中NK1.1和CD122的表达阳性率也显著降低(图3C、D);但 miR-150敲除小鼠脾脏NKT细胞中NK1.1和CD122的表达与对照小鼠相比，没有显著变化(图3E、F)。通过比较miR-150敲除与WT对照小鼠脾脏NK及胸腺NKT细胞NK1.1和CD122的平均荧光强度(MFI)，发现与WT小鼠相比，miR-150敲除小鼠 NK及胸腺NKT细胞中NK1.1的表达没有显著变化，而CD122的表达显著降低(图3G、H)。

2.4 miR-150敲除促进NK和NKT细胞凋亡miR-150缺失引起的NK和NKT细胞减少除与其发育有关外，还可能与细胞凋亡或增殖异常有关。采用荧光标记的磷脂结合蛋白Annexin V染色检测细胞凋亡，发现与WT对照小鼠相比，miR-150基因敲除小鼠NK和胸腺NKT细胞凋亡显著增加(图4A～D)。

2.5 miR-150敲除抑制NK细胞增殖 采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)体内掺入法检测miR-150缺失对NK和NKT细胞增殖的影响，发现与WT对照小鼠细胞相比，miR-150基因敲除小鼠脾脏NK细胞的增殖能力显著降低，而miR-150缺失对小鼠NKT细胞的增殖能力没有显著影响(图5A～D)。

图1 miR-150敲除不影响调节性T细胞(Treg)和γδT细胞的产生Fig.1 Production of Treg and γδT cells in miR-150KO mice

图2 miR-150敲除小鼠NK细胞和胸腺NKT细胞数量显著降低Fig.2 Decreased NK and thymus NKT cells in miR-150KO mice

图3 miR-150敲除致小鼠NK和胸腺NKT细胞CD122表达降低Fig.3 Decreased CD122 expression in NK and thymus NKT cells of miR-150KO mice

图4 miR-150敲除促进小鼠NK和NKT细胞凋亡Fig.4 Increased apoptosis of NK and thymus NKT cells in miR-150KO mice

图5 miR-150敲除抑制小鼠NK细胞增殖Fig.5 Decreased proliferation of NK cells in miR-150KO mice

3 讨论

miR-150是在免疫细胞中普遍表达的一种microRNA，已有研究表明，miR-150在B细胞的发育、分化中发挥作用，但不影响胸腺传统T细胞的发育和成熟。在此研究中，我们发现miR-150的缺失对另外两类重要的T细胞亚群-Treg和γδT细胞的产出也不发挥主要作用。有意思的是，在具有相似表型和功能的两类参与固有免疫应答的细胞NK和NKT细胞中，miR-150的存在直接影响二者的发育和自稳，miR-150敲除NK和胸腺NKT细胞NK1.1和CD122阳性细胞比例和CD122的表达显著降低，NK细胞的凋亡增加，增殖降低。同时，miR-150的缺失也导致胸腺NKT细胞的凋亡增加，但对其增殖影响不显著。

NK细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，NK前体细胞能够迁移至胸腺、脾脏、肝脏、淋巴结等部位，进一步发育分化为成熟NK细胞并主要分布于外周血和脾脏。NK细胞的发育和成熟受一系列细胞因子的调控，其中，IL-2和IL-15是最重要的两个细胞因子，二者共用IL-2受体βγ亚单位，激活相同的信号通路。NK细胞在IL-2的作用下表现为较强的活化、增殖作用，而IL-15可以维持 NK 的生存，抑制其凋亡［14，15］。NK1.1和CD122是小鼠NK细胞相对特异性标记分子，在成熟NK细胞中表达显著增加。更为重要的是，CD122为IL-2受体β链，为IL-2和IL-15的共用受体，CD122表达降低致NK细胞发育和成熟障碍［16，17］。

NKT细胞因其细胞表面既表达TCRα链(小鼠:Vα14-Jα18，人:Vα24-Jα18)和 Vβ 链(小鼠:Vβ8.2、Vβ7、Vβ2，人:Vβ11)，同时又表达 NK 细胞受体如NK1.1、IL-2/15 受体 β(CD122)等而命名［18］。NKT前体细胞产生于胸腺，但其最后阶段的发育、成熟过程既可在胸腺直接完成，也可离开胸腺进入肝脏、脾脏、骨髓和淋巴结等外周免疫器官完成。因此，NKT细胞的发育、成熟既发生在胸腺，也发生在外周免疫器官。同时。NKT细胞的发育、成熟也伴随着多种细胞表面分子的表达变化，如CD44、NK1.1、CD122等的表达增加［19］。与NK细胞一样，IL-15也是调控NKT细胞发育、成熟及自稳的关键细胞因子［20，21］。

在此研究中，我们发现与正常对照小鼠相比，miR-150敲除小鼠NK及胸腺NKT细胞数量显著减少。由于NK细胞占胸腺细胞比例很低(0.02%，图2A)，所以我们主要选取脾脏NK细胞进行后续实验的研究。进一步研究发现，miR-150敲除主要导致具有NK1.1+CD122+成熟表型的NK和NKT细胞比例的降低，表明miR-150促进NK和NKT细胞的发育、成熟。与正常对照小鼠相比，miR-150敲除小鼠脾脏NKT细胞数量正常图2 d，提示在终末成熟阶段，NKT细胞在胸腺和外周可能存在不同的调控机制，而miR-150对于外周NKT细胞的发育、成熟不发挥主要作用。鉴于CD122在miR-150敲除小鼠NK和NKT细胞中的表达降低以及IL-15在二者发育、成熟和自稳中的重要作用。我们进一步研究了miR-150敲除对于NK和NKT细胞凋亡和增殖的影响，结果证实，miR-150敲除所致NK和NKT细胞的减少与其凋亡增加有关。同时，miR-150缺失也导致NK细胞的增殖降低，但对NKT细胞的增殖没有显著影响，表明NKT细胞CD122的表达主要在于维持其自稳功能，而NKT的增殖可能主要与其TCR活化信号有关［22，23］。

总之，本研究发现miR-150在调控NK和NKT细胞发育和自稳过程中发挥作用，miR-150缺失所致NK和NKT细胞的数量减少与其增殖降低和/或凋亡增加有关，CD122可能在以上过程中发挥重要作用。由于特异microRNA的缺失通常引起其靶基因的表达增加，由此推测，miR-150敲除小鼠NK和NKT细胞中CD122的表达变化可能不是miR-150直接作用的结果。我们以前实验结果也表明，miR-150在NKT细胞中可能主要通过c-myb调控NKT细胞的发育［24］。因此，c-myb是否影响CD122的表达以及c-myb在NK细胞发育的作用尚需在以后实验中深入探讨。

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