IL-18对9L胶质瘤细胞表面分子表达影响的体内外研究

宋杨英 张建军 陈 颖 单保恩 刘英姿(河北省玉田县医院检验科，玉田 064100)

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。由于其恶性程度高、侵袭性强、复发率高，常规手术、放化疗效果均不佳。免疫治疗成为一种治疗胶质瘤的新方法。多种免疫刺激剂已经应用到了胶质瘤的免疫治疗中［1］，以增强机体抗肿瘤作用，比如IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IFN-γ、IL-12［2，3］。机体通过免疫监视功能识别、杀伤并清除体内突变细胞，防止肿瘤的发生。胶质瘤细胞能够逃逸机体免疫监视功能与其本身特有的免疫学特征密不可分。①胶质瘤细胞表面MHC类分子表达低，细胞免疫原性弱，导致T细胞抗肿瘤活性下降［4，5］。②胶质瘤细胞表面共刺激分子和黏附分子表达降低［6］，肿瘤抗原呈递不足。③胶质瘤细胞分泌多种免疫抑制因子［7］，影响肿瘤微环境，使肿瘤局部淋巴细胞浸润减少，影响T细胞的免疫反应［8，9］。因此若能够上调胶质瘤细胞表面MHC类分子和(或)CD80、CD86的表达，将对提高机体免疫功能、抑制胶质瘤生长，起到至关重要的作用。

IL-18是一种多效性细胞因子，由于其能够诱导IFN-γ产生，增强Th1型反应，诱导Th1/Th2细胞分化，增强NK活性，调节机体细胞免疫和体液免疫等多种生物学功能，已被证实有很强的抗肿瘤作用［10，11］。因此，本研究拟通过体内和体外实验探讨外源性IL-18基因转染对大鼠胶质瘤细胞表面分子表达的影响，为IL-18应用于胶质瘤的临床治疗奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和动物 9L/IL-18、9L/LXSN及9L细胞由河北医科大学第四医院科研中心构建并保存;5～6周龄，雄性Fischer344大鼠(F344大鼠)购自北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证号:0191929)。

1.1.2 试剂和仪器

1.1.2.1 主要试剂 DMEM培养基、RPMI1640培养基购自美国Gibco/BRL公司;胎牛血清(FCS)购自杭州四季青公司;PE标记抗大鼠CD80抗体、FITC标记抗大鼠CD86抗体、APC标记抗大鼠MHCⅠ类分子抗体、FITC标记抗大鼠MHCⅡ类分子抗体购自eBioscience公司。

1.1.2.2 主要仪器 流式细胞分析仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 流式细胞术检测细胞表面MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子及共刺激分子CD80、CD86的表达收集对数生长期9L/IL-18、9L/LXSN、9L细胞各两瓶，分别用PBS洗细胞1 000 r/min×5 min×2次，0.25%胰酶消化后将细胞分别收集于流式小管中，PBS洗1 000 r/min×5 min×2次，分别加入PE标记抗大鼠CD80抗体，FITC标记抗大鼠CD86抗体，APC标记抗大鼠MHCⅠ抗体，FITC标记抗大鼠MHCⅡ抗体，常温避光作用30 min，PBS洗1 000 r/min×5 min×2次后，流式细胞分析仪检测。

1.2.2 建立大鼠脑胶质瘤模型

1.2.2.1 细胞准备 ①收集对数生长期9L/IL-18、9L/LXSN及9L细胞，PBS将细胞稀释为浓度1×108ml－1细胞悬液各1.0 ml，吹打混匀后将细胞悬液移入1.5ml Eppendorf(EP)管，置于冰上待接种。②分别取10 μl 9L/IL-18、9L/LXSN 及9L 细胞悬液，PBS稀释10倍，加入台盼蓝染液，混匀后各取10 μl于细胞计数板下观察，死细胞被染成蓝色，活细胞圆形透明，不被染色。计数200个细胞，计算活细胞比例。三种细胞内活细胞比例均＞95%。

1.2.2.2 立体定向技术建立大鼠脑胶质瘤模型①将5～6周龄雄性F344大鼠随机分成3组，每组5只。②接种方法:2%戊巴比妥钠注射液将F344大鼠腹腔注射麻醉后，固定于大鼠脑立体定向仪上。头部部分去毛常规消毒后沿头正中线纵向切开头皮，暴露出前囱部位。用牙科钻在前囱中点前1.0 mm，矢状缝右3.0 mm处钻一骨孔。10 μl微量进样器抽取细胞悬液10 μl，固定于三维手动推进仪上，经骨孔垂直进针6.0 mm，再回退1.0 mm后缓慢将细胞悬液推注入大鼠颅内。推注完毕后留针5 min，待细胞充分沉淀后缓慢拔出针头，缝合头皮切口(见图1、2)。手术在无菌条件下进行。手术结束后，由实验动物中心继续按SPF饲养动物［1］。接种14 d后分别取大鼠肿瘤组织用于后续实验。

1.2.2.3 流式细胞分析技术检测肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子、共刺激分子CD80、CD86的表达 将新鲜大鼠肿瘤组织制成单细胞悬液，PBS洗1 000 r/min×5 min×2次，分别加入PE标记抗大鼠CD80抗体，FITC标记抗大鼠CD86抗体，APC标记抗大鼠MHCⅠ类分子抗体，FITC标记抗大鼠MHCⅡ类分子抗体，常温避光染色30 min，PBS洗1 000 r/min×5 min×2次后用流式细胞分析仪检测。

1.3 统计学分析 采用SPSS13.0软件进行数据分析。实验数据以表示。P＜0.05为差异有统计学意义，P＞0.05为差异无统计学意义。

2 结果

2.1 体外细胞表面分子的表达 9L/IL-18、9L/LXSN及9L细胞表面 CD80、CD86、MHCⅠ、Ⅱ类分子的表达均无显著差异(P＞0.05)。见表1。

2.2 IL-18对肿瘤组织细胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、Ⅱ类分子表达的影响 接种9L/IL-18细胞大鼠肿瘤组织中CD80、CD86、MHCⅠ类分子均高于9L/LXSN和9L组，且差异有统计学意义(P＜0.05);后两组相比，差异无统计学意义(P＞0.05);MHCⅡ类分子的表达，三组无显著差别(P＞0.05)。见图3、表2。

图1 立体定向技术建立动物模型Fig.1 Establish animal models by stereotactic technique

图2 接种不同细胞10 d后大鼠状态Fig.2 Status of rats implanted with different cells for 10 days

表1 不同细胞表面MHCⅠ、MHCⅡ、CD80和CD86的表达Tab.1 Expression of MHCⅠ，MHCⅡ，CD80 and CD86 on different cells

表2 不同肿瘤组织MHCⅠ、MHCⅡ、CD80和CD86的表达Tab.2 Expression of MHCⅠ，MHCⅡ，CD80 and CD86 on different tumor tissue cells

图3 流式细胞分析技术检测接种不同细胞大鼠肿瘤组织CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ的表达Fig.3 Expression of CD80，CD86，MHCⅠ、MHCⅡ in tumor tissues from rats implanted with different cells by FCM

3 讨论

本实验所用9L胶质瘤细胞源于纯种近交系Fischer大鼠，与Fischer344大鼠MHC有高度同源性。研究表明，9L/Fischer344大鼠胶质瘤模型在成瘤效果、肿瘤组织形态学特点及肿瘤局部细胞免疫反应等方面与C6/Wistar大鼠胶质瘤模型均存在明显差别，前者更适合于肿瘤基因免疫治疗的研究［12］。

提高肿瘤细胞免疫原性，上调免疫协同刺激因子的表达，可增强机体对肿瘤细胞的识别，从而促进局部免疫反应，抑制肿瘤的免疫逃逸。本实验中，转染了IL-18基因后，在体外并不影响9L胶质瘤细胞表面MHC类分子的表达，然而，在体内IL-18可明显上调胶质瘤组织细胞表面MHCⅠ类分子表达，表明在体内IL-18可增加胶质瘤细胞免疫原性，增强CD8+T对肿瘤的杀伤作用。

研究表明，胶质瘤患者的免疫能力下降，主要是T细胞的抗肿瘤活性下降［9］。胶质瘤细胞可表达FasL，诱导活化的T细胞发生凋亡(活化T细胞表达 Fas)，使肿瘤微环境中浸润的 T 细胞减少［7，8］。我们的实验结果表明，9L/IL-18细胞可明显上调胶质瘤细胞表面MHCⅠ类分子及共刺激分子CD80、CD86表达。MHCⅠ类分子的表达使胶质瘤细胞免疫原性增强，提高免疫系统的免疫监视功能;另外共刺激分子CD80、CD86表达增加，提供了更多T细胞活化的第二信号，可以更多地激活T细胞、促进T细胞增殖、提高T细胞对肿瘤抗原的反应性。

可见，在体内，IL-18可增强9L细胞的免疫原性及抗原递呈，提高机体抗胶质瘤能力。我们认为IL-18转染对9L细胞体内外作用不同，是由于在体内IL-18对大鼠整体免疫功能的调节增强了局部抗肿瘤作用。另外，在实验中我们发现接种了9L/IL-18组大鼠外周血中TGF-β水平显著下降，CD8+T细胞比例明显增加，可见IL-18能够改变胶质瘤大鼠外周血免疫抑制状态，提高其免疫功能，但是外周血的改变是否影响颅内肿瘤微环境同样改变还不明确。

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