SASR-CoV核衣壳蛋白在杆状病毒-昆虫系统的克隆表达及抗原性分析①

黄 莉 余志武 潘玉先 丘立文 郝 卫 丁细霞 车小燕 余 楠

(南方医科大学珠江医院检验医学部，广州 510282)

前期研究证实SARS-CoV的核衣壳蛋白(N)可诱导产生强烈的体液和细胞免疫，是主要的抗原分子［3，4］，也是 SARS-CoV 临床诊断的最佳靶标和预防疫苗的候选蛋白［3，5］。本实验室前期工作采用大肠杆菌表达系统表达了带GST标签的重组SARS-CoV的N蛋白(SARS-NP)，并建立了N抗原捕获抗体夹心ELISA方法用于SARS-CoV 感染的早期诊断［6，7］。为进一步比较研究SARS-CoV、MERS-CoV以及可能出现的新型人冠状病毒的N蛋白抗原性及其相关功能，我们拟采用能表达更接近于高等真核生物天然性状蛋白的杆状病毒-昆虫系统，表达重组SARS-CoV核衣壳蛋白(N)。杆状病毒-昆虫系统具有与哺乳动物相似的复杂的翻译后修饰功能，较原核生物表达系统更适合于表达蛋白的生物活性和免疫原性。

本文在杆状病毒-昆虫系统表达了重组SARSNP，并采用原核系统表达的重组SARS-NP兔免疫血清、单抗和SARS患者血清验证其抗原反应性，并初步研究了其与人冠状病毒229E型(hCoV-229E)和OC43型(hCoV-OC43)的单抗和患者血清的交叉反应性。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 模板、细胞和质粒及主要试剂 携带SARSCoV N基因全长序列的质粒pGEX-5X-3/N由香港大学微生物系提供;pFastBac HTC载体、DH10Bac细胞、Sf9细胞和 High Five细胞、Sf-900Ⅱ SFM、Express Five SFM、Grace's Insect Medium、Cellfectin II Reagent均为美国 Invitrogen公司产品;QIAquick PCR Purification Kit、Min Elute Gel Extraction Kit、QIAprep Spin Miniprep Kit、His-融合蛋白纯化试剂盒购自德国QIAGEN公司;Thermo Scientific Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate试剂盒(ECL)为美国Thermo公司产品。

1.2 血清标本 SARS恢复期血清为2004年收集的SARS确诊患者的血清;hCoV-229E和hCoVOC43的血清为经实时定量PCR测定呼吸道标本为229E和OC43感染的患者的恢复期血清。健康人血清为各项体检指标正常的健康人血清。

1.3 目的基因扩增 SARS-CoV N基因全长序列引物为上游:5'-cgggatccggATGTCTGATAATGGAC-3'(26 bp)，下游 5'-gcgtcgacTTATGCCTGAGTTGAATC-3'(26 bp);目的片段长度1 269 bp。由上海生工生物技术公司合成。以pGEX-5X-3/N为模板，含BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶酶切位点引物序列扩增SARS-NP全长基因。PCR反应条件:94℃预变性2 min，22个循环(94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min)，72℃ 延伸 7 min。1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。

1.4 pFastBac HTC-SARS载体和杆粒DNA构建扩增产物纯化后连接pMD19-T载体，经筛选、PCR扩增鉴定和基因测序，挑取测序正确阳性克隆，BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切、切胶纯化回收，定向插入pFastBacHTC载体，转化DH5α感受态细胞;阳性克隆经PCR扩增、酶切鉴定、基因测序，获得重组质粒 pFastBac HTC-SARS-NP，将其转化DH10Bac感受态细胞，经筛选，双重PCR扩增鉴定，获得重组杆粒DNA。

1.5 SARS-NP杆状病毒液扩增及SARS-NP的表达和纯化 按操作说明，Sf9细胞2 ml(8×105cells/孔)加至6孔板，加入210 μl/孔 DNA和 CellfectinⅡReagent混合，27℃培养至显微镜可见病变，收取病毒液，取上清感染Sf9细胞扩增。

取3.5×107pfu/ml上述杆状病毒液感染2×106cells/ml High Five细胞，MOI为5，27℃孵育72 h表达SARS-NP，PBS清洗细胞，裂解缓冲液重悬，冻融一次后取上清，加入0.1%PMSF，经His-融合蛋白纯化试剂盒纯化，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。

在作品中，男女的“牺牲”不同。时雄抛弃了身份、社会地位和逻辑的束缚，舍弃对芳子的爱或贪心。然后，田中也为了自己的东京的前途的光明而舍弃了芳子。另一方面，芳子为了田中的前途，牺牲了自己的梦想和未来。这两种类型的“牺牲”有什么理由呢？

1.6 双抗体夹心ELISA方法鉴定SARS-NP 采用本实验室建立的双抗体夹心的ELISA方法鉴定重组的SARS-NP，具体步骤详见文献［7］。该方法针对SARS-NP的特异性高达99.86%［7］。

1.7 免疫印迹 纯化蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转印至 PVDF膜，7%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别与前期制备的抗SARS-NP单抗(8A1E17)(1∶500稀释)、抗hCoV-229E和抗 hCoV-OC43的杂交瘤上清(1∶200 稀释)、SARS-CoV、hCoV-229E、hCoV-OC43兔免疫血清(1∶100稀释)、SARS患者血清和 hCoV-229E、hCoV-OC43患者血清(1∶100稀释)室温孵育1 h，洗膜，相应的HRP标记羊抗鼠/兔/人IgG(1∶1 000稀释)避光室温孵育30 min，ECL 显色［6，8，9］。

2 结果

2.1 重组质粒pFastBac HTC-SARS-NP的构建和鉴定 PCR扩增获得SARS-NP基因，全长1 269 bp(如图1)，经测序比对，与GeneBank公布的SARS-NP基因序列一致。BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切鉴定，重组质粒pFastBacHTC-SARS-NP目的基因正确插入目标位点(图1);测序证实重组质粒序列正确。

2.2 SARS-NP重组的杆粒DNA鉴定 SARS-NP重组杆粒DNA经两次PCR鉴定。第一次为针对目的片段特异性引物扩增，结果与理论预期1 269 bp一致(图2A);第二次为M13上游通用引物和下游目的片段特异引物扩增，结果与理论3 019 bp一致(图2 B);PCR阴性对照均为阴性(结果未显示)。

2.3 SARS-NP的表达和纯化 经细胞数(1×106～3×106cells/ml)、MOI(1、2、5)和表达时间(24、48、72 h)优化，细胞数2×106cells/ml，MOI为 5，表达72 h，可获得表达量为0.2 mg/ml、相对分子量为48 kD可溶性蛋白(图3)。经Ni-NTA亲和树脂纯化，SARSNP重组蛋白出现相对分子量约35 kD的蛋白条带，推测为降解物(图3)。

2.4 SARS-NP抗原性分析

2.4.1 双抗体夹心ELISA方法鉴定SARS-NP融合蛋白 双抗体夹心ELISA方法鉴定杆状病毒表达系统表达的SARS-NP融合蛋白，结果显示，阴性对照(未感染的 Sf9细胞溶液)OD450值0.070，SARSNP的OD450值/阴性对照OD450值≥2。

2.4.2 免疫印迹印证SARS-NP的免疫抗原性 抗SARS-NP单抗(8E1A17)、原核表达的SARS-NP兔免疫血清、13份SARS患者血清与杆状病毒表达系统表达的SARS-NP反应。结果SARS-NP单抗在48、35 kD位置出现条带(图4A)，提示SARS-NP有抗原反应性，同时可能存在一定程度降解;原核表达的SARS-NP兔免疫血清与杆状病毒表达系统表达的SARS-NP在48 kD处可见条带;8份SARS患者血清可见明显显色条带，5份SARS患者血清见较弱带;6份正常人血清则未见条带(图4B和C)。

图1 重组质粒pFastBac HTC-SARS-NP的双酶切鉴定图Fig.1 Endonuclease identification of recombinant plasmid pFastBac HTC-SARS-NP

2.4.3 免疫印迹验证SARS-NP与其他冠状病毒(hCoV-229E、hCoV-OC43)之间的抗原相关性 抗hCoV-229E和抗hCoV-OC43的杂交瘤培养上清、hCoV-229E和hCoV-OC43的兔免疫血清以及相应患者血清各5份与杆状病毒表达系统表达的SARSNP反应。结果无条带出现，说明杆状病毒表达系统表达的SARS-NP与hCoV-229E和hCoV-OC43免疫血清无交叉反应(图4C)。

图2 SARS-NP杆粒DNA的PCR鉴定Fig.2 PCR analysis of SARS-NP recombinant Bacmid DNA

图3 SDS-PAGE分析SARS-NP的表达与纯化Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed and purified SARS-NP

图4 免疫印迹分析SARS-NP的免疫原性Fig.4 Western blot analysis of antigenicity of SARS-NP

3 讨论

2002年，广东省最先报道了 SARS，随后30多个国家共报道了8 000多例SARS感染病例，死亡率高达5%～10%［4，10］。为早期诊断SARS-CoV 感染，国内外研究者以SARS-CoV的主要抗原分子核衣壳蛋白作为靶标。有研究采用大肠杆菌表达系统获得重组N蛋白，并建立了ELISA方法以及病毒裂解液和重组蛋白结合的免疫印迹方法［11-13］。

原核表达系统操作简单、价格低廉、周期短，是迄今研究最为成熟、使用最为广泛的表达系统，本实验室前期工作也采用原核系统表达出SARS-NP，但原核表达系统不能产生糖基化、脂肪酸酰化、磷酸化等翻译后修饰，重组蛋白的生物活性、功能、结构与天然蛋白差别较大［14］。而杆状病毒-昆虫系统具有与哺乳动物相似的复杂翻译后修饰功能，如蛋白质的正确折叠与切割、二硫键形成、糖基化、磷酸化、酰化等［15，16］，一定程度上弥补了原核表达系统的缺陷。

本研究通过PCR扩增获得SARS-CoV NP全长基因，经两个限制性内切酶酶切，定向插入pFastBac HTC载体，成功构建了pFastBac HTC-SARS-NP重组质粒，在High Five细胞表达，获得了重组SARS-NP。免疫印迹实验显示其能与原核表达的SARS-NP的单抗、兔免疫血清以及SARS患者血清反应，而与健康人血清、本地区其他常见冠状病毒(hCoV-229E、hCoV-OC43)免疫血清没有交叉反应，说明杆状病毒-昆虫系统的重组SARS-NP具有抗原反应性，与hCoV-229E、hCoV-OC43抗血清无交叉反应。

SARS-NP理论等电点为10.1，具有高亲水性，无半胱氨酸残基和二硫键，因而稳定性较其他结构蛋白差［17］;在杆状病毒-昆虫系统表达外源蛋白过程中，病毒本身会表达半胱氨酸蛋白酶等蛋白酶;High Five细胞应激也会分泌蛋白酶［18-20］;这些因素均可导致蛋白在表达过程中降解，这可能是本研究中获得一部分相对分子量为35 kD蛋白的原因。虽然优化了实验条件，但降解仍未能彻底消除(未附结果)。重组蛋白的降解可能可从几个方面解决:(1)构建蛋白酶基因缺失载体;(2)控制表达时间;(3)添加蛋白酶抑制剂［20］。在免疫印迹实验中，重组蛋白与兔免疫血清的结合较差，血清效价存在一定程度的损失;可能是由于兔免疫血清为原核来源的重组蛋白免疫所得，保存年份较久远(2003年制备)。

综上所述，本研究在杆状病毒-昆虫系统中获得重组的 SARS-NP，验证了抗原性，初步研究其与hCoV-229E、hCoV-OC43的交叉反应性，为下一步SARS-NP的功能和诊断方法的建立，以及进一步比较MERS-CoV和其他新型冠状病毒N蛋白的抗原性和相关功能研究奠定了实验基础。

［1］Ren AX，Xie YH，Kong YY，et al.Expression，purification and sublocalization of SARS-CoV nucleocapsid protein in insect cells［J］.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2004，36(11):754-758.

［2］Muller MA，Raj VS，Muth D，et al.Human coronavirus EMC does not require the SARS-coronavirus receptor and maintains broad replicative capability in mammalian cell lines［J］.MBio，2012，3(6):e00515-12.

［3］Liu RS，Yang KY，Lin J，etal.High-yield expression of recombinant SARS coronavirus nucleocapsid protein in methylotrophic yeast Pichia pastoris［J］.World J Gastroenterol，2004，10(24):3602-3607.

［4］Zhou B，Liu J，Wang Q，et al.The nucleocapsid protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus inhibits cell cytokinesis and proliferation by interacting with translation elongation factor 1alpha［J］.J Virol，2008，82(14):6962-6971.

［5］Suresh MR，Bhatnagar PK，Das D.Molecular targets for diagnostics and therapeutics of severe acute respiratory syndrome(SARSCoV)［J］.J Pharm Pharm Sci，2008，11(2):1s-13s.

［6］车小燕，丘立文，潘玉先，等.SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的快速、高效制备的方法研究［J］.第一军医大学学报，2003，23(7):640-642.

［7］丘立文，汤汉文，王亚娣，等.酶联免疫吸附试验间接抗体夹心检测SARS-CoV抗原方法的建立和应用［J］.中华流行病学杂志，2005，26(4):277-281.

［8］丘立文，王压娣，廖志勇，等.人冠状病毒SARS-CoV、229E和OC43核衣壳(N)蛋白单克隆抗体的制备及3株人冠状病毒N蛋白的抗原相关性观察［J］.南方医科大学学报，2006，26(3):290-293.

［9］车小燕，廖志勇，王压娣，等.SARS-CoV、HCoV-229E和OC43核衣壳蛋白的克隆表达及抗原相关性分析［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2005，25(9):711-715.

［10］Lai C W，Chung Y C，Lai Y K，et al.Expression and purification of N and E proteins from severe acute respiratory sy-ndrome(SARS)-associated coronavirus:a comparative study ［J］.Biotechnol Lett，2005，27(13):883-891.

［11］Shi Y，Yi Y，Li P，et al.Diagnosis of severe acute respiratory syndrome(SARS)by detection of SARS coronavirus nucleocapsid antibodies in an antigen-capturing enzyme-linked immunosorbent assay［J］.J Clin Microbiol，2003，41(12):5781-5782.

［12］Woo PC，Lau SK，Wong BH，et al.Detection of specific antibodies to severeacuterespiratorysyndrome(SARS) coronavirus nucleocapsid protein forserodiagnosis ofSARS coronavirus pneumonia［J］.J Clin Microbiol，2004，42(5):2306-2309.

［13］Guan M，Chen HY，Tan PH，et al.Use of viral lysate antigen combined with recombinant protein in Western immunoblot assay as confirmatory test for serodiagnosis of severe acute respiratory syndrome［J］.ClinDiagnLab Immunol，2004，11(6):1148-1153.

［14］孙柏欣，刘长远，陈 彦，等.基因表达系统研究进展［J］.现代农业科技，2008，(2):205-209.

［15］高炳淼，李宝珠，于津鹏，等.外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达［J］.中国生物工程杂志，2011，(11):123-131.

［16］van Oers M M.Opportunities and challenges for the baculovirus expression system［J］.J Invertebr Pathol，2011，107(Suppl):S3-S15.

［17］Cao S，Wang H，Luhur A，et al.Yeast expression and characterizat ion of SARS-CoV N protein［J］.J Virol Methods，2005，130(1-2):83-88.

［18］范翠英，冯利兴，樊金玲，等.重组蛋白表达系统的研究进展［J］.生物技术，2012，2(22):76-80.

［19］Murphy CI，Piwnica-Worms H.Overview of the baculovirus expression system［J］.Curr Protoc Protein Sci，2001，Chapter 5:t4-t5.

［20］吴小锋，曹翠平，鲁兴萌.昆虫杆状病毒表达系统中重组蛋白质的降解及其对策［J］.蚕业科学，2005，(4):382-388.