孕妇血清妊娠相关蛋白A鲁米诺氧通道免疫测定方法的建立①

郝颖新 侯丽英 周宇捷 张月香 李会强

(天津医科大学医学检验学院临床免疫学教研室，天津 300203)

妊娠相关蛋白A(Pregnancy associated plasm a protein A，PAPP-A)是一种由胎盘合体滋养层细胞和蜕膜产生的，与妊娠相关的大分子糖蛋白。孕早期在母体外周血中即可检测到PAPP-A，且随孕周增加，其水平会持续上升，孕足月时达到高峰［1，2］。目前，国际上普遍认为，PAPP-A是孕早期筛查唐氏综合征的敏感指标［3］，而且近年来，有研究发现，PAPP-A对许多妊娠并发症也有一定的预测能力，包括妊娠期高血压疾病、胎儿宫内生长受限、出生低体重儿及妊娠期糖尿病等［4-6］。因此，它是一个重要的产前筛查指标。

目前检测PAPP-A的最常用方法是时间分辨荧光分析法(Time resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)，但其操作繁琐，需反复洗板，耗时长。鲁米诺氧通道免疫测定(Luminescent oxygen channeling immunoassay，LOCI)技术问世于上世纪90年代，具有均相、免清洗高检测性能等优点，本实验利用该方法建立了定量检测血清PAPP-A的方法，并对检测性能进行了初步评价。

1 材料与方法

1.1 血清标本 选自天津市中心妇产科医院孕早期(孕9～13+6周)正常产检孕妇血清标本50份及健康体检男性混合血清。

1.2 主要试剂和仪器 受体微球和链霉亲和素化的供体微球购自上海博阳生物科技有限公司;兔抗人PAPP-A多克隆抗体和鼠抗人PAPP-A单克隆抗体购自英国Abcam公司;长臂活化生物素(NHS-LCBiotin)购自美国Pierce公司;96孔发光微孔板和光激化学发光检测仪购自上海博阳生物科技有限公司。

1.3 受体微球包被 取受体微球，按照参考文献［7］的方法，用兔抗人PAPP-A多克隆抗体包被，调节受体微球浓度为1 mg/ml，避光保存于4℃备用。

1.4 生物素标记 参照产品说明书，将活化生物素溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，按照生物素与鼠抗人PAPP-A单克隆抗体的摩尔比为20∶1的比例将生物素缓慢、逐滴加入抗体溶液中，室温反应1 h;用0.01 mol/L PBS溶液于4℃透析24 h去除游离生物素，分装，4℃保存备用。

1.5 标准品的配制 取PAPP-A纯品，用含20%灭活小牛血清0.1 mol/L、pH7.8的Tris-HCl缓冲液配制成不同浓度的标准品溶液:0、40、160、800、3 200、8 000 mU/L，并利用质控血清进行校准，分装后－20℃保存备用。

1.6 检测步骤 向微孔板中依次加入50 μl生物素化抗体、10 μl待测样品、50 μl受体微球，37℃ 孵育15 min，避光条件下再加入140 μl感光微粒，37℃孵育8 min后用化学发光检测仪检测光信号，以标准品浓度为横坐标，光信号强度为纵坐标，用四参数拟合方式绘制PAPP-A浓度-光信号强度标准曲线，并获得数学函数方程，根据光信号强度通过数学函数计算待测标本中PAPP-A的浓度。

1.7 检测性能评价

1.7.1 灵敏度 以零参考值标准品当做样品重复检测20次，计算其均值及标准差。以其测定值的均值加上两倍的标准差所得信号值，代入标准曲线方程计算得其分析灵敏度;将低值标本倍比稀释后重复测定10次，当CV＞20%时所对应的浓度值，即为该方法功能灵敏度。

1.7.2 精密度 取孕早期(孕9～13+6周)正常产检孕妇的血清配制成高、中、低值的待测样本，分装后－20℃冷冻保存。每个浓度的标本分别连续测定10次计算各浓度批内的均值、标准差及变异系数(CV);每个浓度每天测定一次，连续测定10 d，计算各浓度日间的均值、标准差及CV。

1.7.3 添加回收试验 将健康男性体检者血清分为三份，分别向其中两份加入等体积不同浓度的标准品，添加浓度分别是200、2 000 mU/L，另一份加入同体积但无PAPP-A的基质，用本试验建立的方法检测各样品的浓度值，并按照下列公式计算回收率:回收率(%)=(分析样品测定浓度－基础样品测定浓度)/加入浓度×100%。

1.7.4 干扰性检测 主要通过干扰试验评价，分别向100 μl低值血清和高值血清中加入浓度为210 μmol/L的胆红素、5 g/L的血红蛋白、15 mmol/L的甘油三酯各50 μl，对照样本添加相同体积但无PAPP-A的基质，用本试验建立的方法检测各样品的浓度值，并按照下列公式计算干扰率:干扰率(%)=(基础样品的测定浓度－分析样品的测定浓度)/基础样品的测定浓度×100%。

1.7.5 Hook效应 用BASE稀释液将PAPP-A标准品稀释成 10 个浓度值，20、40、80、160、400、800、1 600、3 200、4 000、8 000(mU/L)，每个浓度值重复测定4次，计算各浓度值均数。

1.7.6 方法学比较 分别用本实验建立的方法和时间分辨荧光分析法检测50例临床标本的PAPP-A含量，以时间分辨荧光分析法测定值为横坐标，以本实验建立方法测定值为纵坐标，绘制散点图，对两种测定方法所得数据做相关分析。

2 结果

2.1 测定方法的建立 选用1∶100、1∶200、1∶300稀释的受体微球(已包被)分别与1∶500、1∶1 000、1∶2 000稀释的生物素化抗体进行组合，然后对最高标准品浓度和零值标准品浓度进行测定，通过棋盘滴定，结果显示最高标准品光信号强度与零值标准品光信号强度比值(P/N)在5 μg/ml受体球与5.86 μg/ml稀释度生物素化抗体组合达到最大值，本实验最适合的生物素化抗体浓度为5.86 μg/ml(1∶500稀释)，最适的受体球浓度是5 μg/ml(1∶200稀释)。标准品剂量-反应曲线如图1，数学模型如下:y=(51 378.13－43.97)/［1+(x/6695.54)－0.986］+43.97。

2.2 方法学评价

2.2.1 灵敏度利用本实验建立的方法检测所得PAPP-A的分析灵敏度为2.8 mU/L，功能灵敏度为4.6 mU/L。

2.2.2 精密度 利用本实验建立的方法检测PAPP-A低、中、高值混合定值血清所得结果，显示该方法的批内变异系数及批间变异系数均＜10% 。测定结果见表1。

2.2.3 添加回收试验 利用本实验建立的方法检测上述分析样品的浓度200、5 000 mU/L，平均回收率分别为100.3%、96.7%。

2.2.4 干扰性检测 利用本实验建立的方法检测上述分析样品，血红蛋白、总胆红素和甘油三酯的干扰率见表2。

图1 PAPP-A剂量-反应曲线Fig.1 Standard curve for PAPP-A

表1 精密度测定结果Tab.1 Precision of LOCI kit

表2 干扰率测定结果Tab.2 Specificity of LOCI kit

2.2.5 Hook效应 本检测方法测定PAPP-A浓度在0～8 000 mU/L范围内未见Hook效应，见图2。

2.2.6 与时间分辨荧光分析法的比较 由线性回归方程及相关系数显示，本实验建立的方法与时间分辨荧光分析法有较好的相关性，回归方程为y=0.970x+71.85，r2=0.989，相关曲线见图3。比较两种方法的检测性能(表3)，可以看出两者无显著差别。时间分辨荧光分析法的检测性能数据来自于PerkinElmer公司生产的PAPP-A试剂盒说明书。

图2 PAPP-A LOCI Hook实验检测信号值Fig.2 Hook experiment signal value of PAPP-A

图3 LOCI法与时间分辨荧光分析法的相关性Fig.3 Linear correlation between LOCI and TRFIA

表3 LOCI法与TRFIA法的性能比较Tab.3 Comparison of LOCI kit and TRFIA kit

3 讨论

PAPP-A是与妊娠相关联的一种大分子糖蛋白，测定孕妇血清PAPP-A含量变化在筛查异常胎儿方面得到国内外学者的证实和重视。当前检测PAPP-A的方法主要有酶联免疫测定法［8］和时间分辨荧光分析法［9］，最常用的是时间分辨荧光分析法，此方法虽然准确性和特异性较高，但是孕妇血清PAPP-A含量高，标本均需要稀释后检测，增加了操作步骤，容易产生误差，同时实验需要两次孵育及洗板过程，耗时2.5 h以上，产检孕妇不能当天获得筛查结果，给临床带来了不便，且利用该方法开发的进口试剂盒成本较高，不适合在基层医疗机构推广使用。

鲁米诺氧通道免疫测定(Luminescent oxygen channeling immunoassay，LOCI)技术是一种通过化学发光检测微粒间的结合，进而检测分析物含量的方法。最初是由 Ullman等［10］在 1994年报道，并由PerkinElmer公司完成商品化。该技术原理是感光微粒在680 nm的光照下激发产生单线态氧，单线态氧在极短距离内(＜200 nm)扩散至发光微粒，与其中的发光物质反应，即可产生560～580 nm的化学发光，根据检测到的光信号强度定量被检测物的浓度。该技术以其独特的检测方法，实现了均相、免洗和高通量检测，彻底避免了清洗和分离所带来的误差［11，12］。国内已有学者利用此项技术建立了促甲状腺激素、胰岛素、绒毛膜促性腺激素等多项微量物质的检测方法［13-15］。

我们建立的血清PAPP-A的LOCI检测方法，其分析灵敏度为2.8 mU/L，功能灵敏度为4.6 mU/L;回收实验的回收率为96.7%～100.3%，符合临床检测回收率在90%～110%的要求;批内精密度与批间精密度分别为5.91%～7.94%和6.14%～9.69%，均小于10%，说明本法有较好的重复性;特异性分析中各干扰物的干扰率均＜10%，说明本法有较强的抗溶血、黄疸及脂血的干扰;本实验有较宽的线性范围(2.8 mU/L～8 000 mU/L)，当PAPP-A浓度高达8 000 mU/L时无Hook效应;本实验结果与时间分辨荧光分析法的检测结果有很好的相关性。

上述实验结果表明本实验初步建立的基于LOCI技术检测PAPP-A的方法，具有较好的检测性能，与其他试剂盒测定结果之间有较好相关性，且操作简便，大大缩短实验时间，有极大的临床应用潜力，下一步可继续进行大样本量实验，建立不同孕周PAPP-A的中位数，为不同孕周正常值参考范围提供依据，有望替代同类进口PAPP-A检测试剂盒。

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