不同类型音乐对老年大鼠脑组织海马区神经细胞凋亡的影响①

何 颖 李淑梅 马洪喜(长春大学音乐学院，长春 130022)

音乐可以鼓舞精神和激活大脑，引起强烈的快感和内在奖赏系统的假定刺激，这表明音乐的存在有利于精神和躯体的健康［1，2］。近年来越来越多的人开始关注音乐对健康的影响，发现弹奏、聆听和创作音乐几乎能够影响每个认知功能，因此音乐提供了研究神经系统科学众多方面的一个工具［3］。本实验在聆听音乐方面，通过音乐刺激老年大鼠，检测血清、脑组织Caspase-3和Livin的水平，从神经细胞凋亡方面探讨不同类型音乐对大鼠神经系统的作用机制为音乐治疗的广泛应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 健康老年雄性Wistar大鼠40只，20月龄，体重(360±20)g，由吉林大学白求恩医学部动物实验中心提供(动物许可证号:SCXK2007-吉大-0003);ELISA试剂盒购于南京建成生物有限公司;兔抗鼠Caspase-3和Livin一抗购于北京博奥森生物有限公司，SP和DAB试剂盒购于福州迈新生物有限公司;实时-PCR试剂购于塔克拉生物试剂有限公司。

1.2 实验分组及实验方法 健康老年雄性Wistar大鼠，随机分为4组:空白对照组10只、莫扎特音乐组10只、梁祝音乐组10只和摇滚音乐组10只。每天上午水迷宫训练同时音乐干预2 h，下午单纯音乐干预2 h，音乐强度为65～85分贝连续7 d，第8天处死大鼠取血液及脑组织，待测试。

1.3 指标检测

1.3.1 血清及脑组织海马区中Caspase-3和Livin蛋白含量的检测 采用ELISA法，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.2 脑组织海马区中Caspase-3和Livin蛋白阳性表达的检测 采用免疫组织化学法检测，取脑组织固定于福尔马林液中，包埋，切片4微米，60℃烤箱烘片4 h，然后脱蜡至梯度酒精至水洗，抗体稀释液浓度均为1∶300，其余步骤严格按照说明书进行，DAB显色后，用苏木精复染，封片。采用Motic Image Advanced 3.2图像分析仪，行半定量分析检测灰度值，阳性表达越高灰度值越低，阳性表达越低灰度值越高。

1.3.3 脑组织海马区中Caspase-3和Livin基因水平的检测 采用实时荧光定量PCR法检测，Caspase-3上游引物:5'-TGGAACAAATGGACCTGTTG-3'，下游引物:5'-AGGACTCAAATTCTGTTGCC-3'，扩增产物256 bp;Livin上游引物:5'-TCCACAGTGTGCAGGAGACT-3'，下游引物:5'-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3'，扩增产物368 bp;β-actin上游引物:5'-CCTAAGGCCTAACCGTCGAA-3'，下游引物:5'-GGATGCCTAGGGCAGTAATC-3'，扩增产物 168 bp。

1.4 统计学分析 血清及脑组织中Caspase-3和Livin的蛋白含量、蛋白表达灰度值及基因变化水平，其实验数据均表示，应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，采用t检验分析。

2 结果

各组大鼠一般状态均好，皮毛光滑、精神饱满。

2.1 血清及脑组织海马区中Caspase-3和Livin蛋白含量的比较 与对照组比较，莫扎特音乐组、梁祝音乐组大鼠血清及脑组织海马区中Caspase-3蛋白含量降低、Livin蛋白含量升高均有统计学意义(P＜0.01)，莫扎特音乐组和梁祝音乐组之间比较无显著差异(P＞0.05);而摇滚音乐组大鼠血清及脑组织海马区中Caspase-3和Livin蛋白含量均无明显改变(P ＞0.05)，见表1。

2.2 脑组织海马区中Caspase-3和Livin蛋白阳性强度的比较 与对照组比较，莫扎特音乐组、梁祝音乐组大鼠脑组织海马区中Caspase-3蛋白阳性表达强度降低、Livin蛋白阳性表达强度升高均有统计学意义(P＜0.01)，莫扎特音乐组和梁祝音乐组之间比较无显著差异(P＞0.05);而摇滚音乐组大鼠脑组织海马区中Caspase-3和Livin蛋白阳性表达强度均无明显改变(P ＞0.05)，见表2，图1、2。

2.3 脑组织海马区中Caspase-3和Livin基因水平的比较 与对照组比较，莫扎特音乐组、梁祝音乐组大鼠脑组织海马区中Caspase-3基因水平降低、Livin蛋白基因水平升高均有统计学意义(P＜0.01)，莫扎特音乐组和梁祝音乐组之间无显著差异(P＞0.05);而摇滚音乐组大鼠脑组织海马区中Caspase-3和Livin基因水平均无明显改变(P＞0.05)，见表2。

表1 各组大鼠血清、脑组织海马区中Caspase-3和Livin蛋白含量的比较(n=10，)Tab.1 Comparision of Caspase-3 and Livin protein contents in serum and hippocampus of brain tissue(n=10，)

表1 各组大鼠血清、脑组织海马区中Caspase-3和Livin蛋白含量的比较(n=10，)Tab.1 Comparision of Caspase-3 and Livin protein contents in serum and hippocampus of brain tissue(n=10，)

Note:Compared with control group，1)P ＜0.01.

Groups Serum(ng/ml)Brain tissue(ng/ml)Caspase-3 Livin 5±0.93 1.03 Mozart music 2.31±0.651)9.51±0.841)3.48±0.751)10.78±0.971)Liangzhu music 2.42±0.491)9.39±0.721)3.53±0.691)10.63±1.121)Rock music 3.09±0.84 8.24±0.68 4.22±0.57 9.4 Caspase-3 Livin Control 3.16±0.52 8.11±0.63 4.33±0.78 9.34±

表2 各组大鼠脑组织海马区中Caspase－3和Livin蛋白阳性强度(灰度值)及基因水平的比较(n=10，)Tab.2 Comparision of Caspase-3，Livin protein levels(grey value)and real-time PCR in hippocampus of brain tissue(n=10，)

表2 各组大鼠脑组织海马区中Caspase－3和Livin蛋白阳性强度(灰度值)及基因水平的比较(n=10，)Tab.2 Comparision of Caspase-3，Livin protein levels(grey value)and real-time PCR in hippocampus of brain tissue(n=10，)

Note:Compared with control group，1)P ＜0.01.

Groups Protein levels(grey value)mRNA Caspase-3 Livin Control 113.24±4.18 110.56±5.24 5.21±0.76 1 Caspase-3 Livin 2 10.22±1.01 0.13±0.98 Mozart music 140.45±5.021)90.15±3.911)4.43±0.611)11.37±1.061)Liangzhu music 136.28±4.671)90.59±4.661)4.55±0.591)11.14±0.881)Rock music 116.53±4.16 116.41±4.72 5.14±0.8

图1 脑组织海马区中Caspase-3的表达(免疫组织化学染色，×400)Fig.1 Caspase-3 expression in hippocampus of brain tissue(Immunohistochemical staining，×400)

图2 脑组织海马区中Livin的表达(免疫组织化学染色，×400)Fig.2 Livin expression in hippocampus of brain tissue(Immunohistochemical staining，×400)

3 讨论

音乐训练可减少因老龄化而造成的记忆力下降，青少年时期学过音乐的人，老了后在记忆和认知能力方面的测试要推迟十年老化［4］。老年人进行持续的音乐活动可提高思维能力，消除因年龄甚至因缺乏教育而带来的负面影响，在这项研究中70名59～80岁的音乐家和非音乐家进行了神经心理测验和调查，在心理测试、视觉空间的判断、言语记忆、回忆和机动灵活性方面，音乐家得分更高［5］。感知和处理音乐并不是后来才加到我们的认识上的，而是已经在我们周围很久，从我们神经系统发展的最初阶段就存在的了［6］。音乐有一个生物学基础，而且大脑对音乐有一个功能组织，许多大脑区域参与了音乐处理过程的特殊方面，无论是对基本的感知还是唤起的情感反应，音乐家似乎具有额外的专门化作用，尤其是对一些大脑结构的超发展，这些效应表明了，音乐学习调节了大脑，增加了个体细胞的应答和细胞的数目［7］。国内外的研究表明特定的音乐对放松身心、振作精神、诱发睡眠等有实效，能提高机体学习记忆能力，能够提高机体抗疲劳、抗衰老及调节机体的免疫机能，随着对音乐和大脑研究的继续，本实验参照国内外大鼠相关研究，采用音乐强度65～85分贝干预，研究音乐干预在神经系统方面的调节机制［8-10］。

Caspase-3与Livin是神经系统中重要的损伤与抗损伤因子。Caspase-3能促进细胞凋亡，使细胞正常死亡;而Livin的表达能够抗细胞凋亡。Caspase家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，在细胞凋亡的分子机制网络中居中心地位。可作用于一些其他的Caspase家族成员，并降解凋亡细胞中的某些成分，导致蛋白酶级联反应放大，最终使细胞凋亡［11］。因此Caspase-3被称为死亡蛋白酶，是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶。大量实验证明，如果在Caspase-3激活之前进行干预，可以有效抑制凋亡的发生［12］。近年用形态学或生化的方法均证实，衰老的脑组织神经元细胞具有典型的凋亡特征;其凋亡与Caspase-3的激活有关，Caspase-3的表达水平可作为衡量神经元损伤的客观指标，其中海马组织较皮层组织可能更为敏感。Livin是一类分子水平的抗细胞凋亡调节因子，它能够钝化宿主对感染的自杀反应，有学者证明，Livin能够直接抑制Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 酶水解作用，可能阻止Caspases蛋白在细胞凋亡时执行蛋白切除功能;Livin可引起Caspases蛋白的降解，还能通过抑制Caspases的活性途径抗凋亡作用［13，14］。本实验结果显示，莫扎特音乐组、梁祝音乐组大鼠血清及脑组织中Caspase-3蛋白含量、蛋白表达和基因水平均较对照组降低有统计学意义(P＜0.01)，Livin蛋白含量、蛋白表达和基因水平均升高有统计学意义(P＜0.01)，莫扎特音乐组略好于梁祝音乐组差异无统计学意义(P＞0.05);而摇滚音乐组大鼠血清及脑组织中Caspase-3和Livin蛋白含量、蛋白表达和基因水平均较对照组无差异无统计学意义(P＞0.05);提示:音乐干预可通过下调Caspase-3、上调Livin水平，抑制神经细胞凋亡，对神经系统具有保护作用，这一结果也为音乐治疗选择背景音乐方面提供了理论依据。

［1］汪 健.关于音乐对人的生理影响的研究［J］.长春师范学院学报(人文社会科学版)，2009，28(3):154-156.

［2］Koelsch S，Walter A S.Towards a neural basis of music perception［J］.Trends in Cognitive Sciences，2005，9(12):578-584.

［3］王 沛，苏 洁.音乐知觉的神经基础研究［J］.心理科学，2007，30(6):1497-1499.

［4］吕建国，章 锐，李艳蕾.老年精神障碍的神经音乐治疗［J］.成都医学院学报，2008，3(1):38-43.

［5］Michael HT，David A.Temporal entrainment of cognitive functions Musical memonics induce brain plasticity and oscillatory synchrony in neural networks underlying memory［J］.Ann N Y Acad SCI 2005，1060(1):243-254.

［6］Morten LK，Edmund TR.The functional neuroanatomy of the human orbitofrontal cortex:evidence from neuroimaging and neuropsychology［J］.Progress Neurobiol，2004，72(11):341-372.

［7］Phan KL，Taylor SF，Robert C，et al.Activation of the medial prefrontal cortex and extended amygdala by individual ratings of emotional arousal:A fMRI study［J］.Biological Psychiatry，2003，53(3):211-215.

［8］Gosselin N，Peretz I，Noulhiane M，et al.Impaired recognition of scary music following unilateral temporal lobe excision［J］.Brain，2005，128(3):628-640.

［9］李 媛.音乐对提高人体免疫功能的多元性［J］.长春大学学报，2012，22(10):1239-1242.

［10］项爱斋，张云亭，张 权，等.音乐刺激激活人脑情感系统的fMRI研究［J］.中国临床心理学杂志，2006，14(2):215-217.

［11］王 莹，李文媛，杨春壮.黄芪皂甙联合BMSCs移植对大鼠脑缺血再灌注海马神经细胞凋亡及Livin、Caspas-e9蛋白的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2011，9(8):979-982.

［12］Kasof GM，Gomes BC.Livin a novel inhibitor of apoptosis protein family member［J］.Biol Chem，2001，276(5):3238-3246.

［13］于 嵩，胡江平.姜黄素对铁负载小鼠脑组织Caspase-3、Caspase-9和Livin蛋白表达的影响及其对神经系统的保护作用［J］.吉林大学学报(医学版)，2013，39(5):868-871.

［14］Ashhab Y，Alian A，Polloack A，et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern［J］.FEBS Lett，2001，495(122):56-60.