抗IL-1β和TNF-αIgY抗体治疗豚鼠过敏性支气管哮喘的机制①

涂 威 向 勤 胡微煦 陈元宜 胡国柱 何 丹 文 珠

(江西省医学科学研究院，南昌 330006)

抗原进入致敏机体的呼吸道后刺激其释放ATP和尿酸激活NLRP3炎症复合体，裂解IL-1β原产生活性IL-1β，IL-1β再诱导多种炎症因子产生并引起气道炎症，增加 TNF-α mRNA 在气管中的表达［1，2］。然而抗TNF-α抗体、可溶性TNF-α受体及IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)治疗哮喘患者及OVA诱导的哮喘模型小鼠和大鼠的疗效肯定［3-6］。本研究应用抗IL-1β和TNF-α IgY抗体联合雾化吸入治疗OVA雾化吸入诱导的过敏性支气管哮喘模型豚鼠，以期探讨其局部治疗过敏性支气管哮喘的可能机制，开辟一种新的治疗方法和治疗途径。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级Hartly豚鼠68只，雄性，7周龄，(230±40)g［长沙市开福区东创实验动物科技服务部，生产许可证SCXK(湘)2009-0012］;抗IL-1β和TNF-α IgY抗体(本室制备，IgY纯度85%，效价1∶3 200/mg蛋白)。使用重组人IL-1β和TNF-α免疫接种产蛋母鸡，收集的鸡蛋黄采用水稀释法提取IgY，两步硫酸铵盐析法纯化IgY，非还原性SDSPAGE测定IgY纯度，免疫酶联吸附法(ELISA)测定IgY特异性抗原结合效价。布地奈德混悬液(1 mg/2 ml，批号 LOT 311385，澳大利亚 AstraZeneca Pty Ltd.);卵清白蛋白(OVA，ovalbumin GradeⅡ，批号A5253，美国 SIGMA 公司);抗豚鼠 IL-1β、IL-4、IL-6、IL-13(批号1106101)、IL-8(批号 1106121)、IL-16(批号 1106102)、TNF-α(批号 1105261)、TGF-β1(批号1105221)、IgE(批号1105205)等 ELISA试剂盒(上海西塘生物科技有限公司)。超声波雾化吸入器(JSC-202型，辽宁省鞍山市医疗器械厂);酶联免疫检测仪(Multiskan Ascent型，美国热电公司)。

1.2 方法

1.2.1 过敏性支气管哮喘豚鼠模型的建立及实验分组 过敏性支气管哮喘豚鼠模型的建立参照文献［7］。豚鼠适应性饲养1周后将其按随机数字表法分为:对照组(C组)15只，模型组(M组)19只豚鼠，1.0%抗TNF-α和IL-1β IgY多克隆抗体治疗组(Z1组)18只，布地奈德混悬液治疗组(Z2组)16只豚鼠。简言之，正常对照组(C组)15只，基础致敏阶段(第1、3、5、7日)雾化吸入 0.9%生理盐水，20 ml/10 min/10只豚鼠/次，连续雾化4次;加强免疫阶段(攻击)(第15至第25日)雾化吸入0.9%生理盐水，20 ml/10 min/10只豚鼠/次，连续雾化11次。过敏性支气管哮喘模型建立:90只豚鼠隔日(第1、3、5、7日)雾化吸入1.0%OVA生理盐水溶液，20 ml/10 min/10只豚鼠/次在雾化箱内超声雾化，连续雾化4次作为基础致敏，豚鼠致敏30 min内出现抓鼻、喷嚏、咳嗽、呼吸加快、口唇紫绀，死亡的豚鼠突然气绝倒毙或四肢抽搐后死亡，其中致敏阶段死亡豚鼠9只;将81只豚鼠经背部皮内注射25 μl的200 μg/ml卵白蛋白生理盐水(0.02%OVA)，20～40 min后注射部位出现红斑和水肿直径大于1.0 mm的皮丘为致敏成功，其中3只豚鼠致敏不成功(占3.70%);剩余78只豚鼠休息一周又死亡6只;72只豚鼠第15天开始加强免疫(攻击)(第15至第25日)，每天雾化吸入1.5%OVA生理盐水溶液，20 ml/10 min/10只豚鼠/次在雾化箱内超声雾化，雾化攻击6次(第15天至第20天)后又死亡15只豚鼠，将剩余57只豚鼠随机分成:模型组(M组)(21只)，第21至第25天先雾化吸入1.5%OVA生理盐水溶液，20 ml/10 min/10只豚鼠/次在雾化箱内超声雾化，然后即刻雾化吸入0.9%生理盐水，20 ml/10 min/10只豚鼠/次;1.0%抗 TNF-α和 IL-1β IgY多克隆抗体治疗组(Z1组)(18只)，第21至第25天先雾化吸入1.5%OVA生理盐水溶液，20 ml/10 min/10只豚鼠/次在雾化箱内超声雾化，然后即刻雾化吸入1.0%抗TNF-α和IL-1β IgY多克隆抗体溶液，20 ml/10 min/10只豚鼠/次在雾化箱内超声雾化;布地奈德混悬液模型豚鼠治疗组(Z2组)(18只)，第21至第25天先雾化吸入1.5%OVA生理盐水溶液，20 ml/10 min/10只豚鼠/次在雾化箱内超声雾化，然后即刻雾化吸入布地奈德混悬液(1 mg/2 ml)，20 ml/10 min/10只豚鼠/次在雾化箱内超声雾化。最后5 d治疗期间M组和Z2组分别死亡2只豚鼠，因此造模成功率为96.67%(87只/90只，死亡豚鼠属于过敏反应死亡)，豚鼠造模死亡率为39.08%(34只/87只)。所有4组豚鼠于末次治疗结束后(第 25 天)的 2、4、8、24 h、4 个时间点被腹腔内注射10%水合氯醛麻醉，行心脏穿刺取血、支气管肺泡灌洗及收集BALF。

1.2.2 血浆和支气管肺泡灌洗及灌洗液采集 豚鼠采用10%水合氯醛(2 ml)腹腔内注射麻醉，胸部剖开暴露心脏穿刺取血5～8 ml置EDTA抗凝管中，然后血液涂片染色进行白细胞分类计数，离心2 000 r/min×10 min取血浆置于－80℃保存。取血后心脏注射空气处死豚鼠，暴露气管，在气管正中做“T”形小切口，插入灌洗针头并结扎，向气管内注入生理盐水2.0 ml反复抽吸并将灌洗液抽出，以1 000 r/min×10 min离心取上清，放置－80℃保存。

1.2.3 细胞染色 将血液细胞滴加于玻片上推片，室温晾干，滴加美蓝固定及染色1～2 min，再滴加伊红染色10 min，蒸馏水冲洗，室温晾干;高倍镜下随机计数200个细胞以上，分类计数。

1.2.4 血浆及支气管肺泡灌洗液细胞因子测定采用双抗夹心ELISA法测定血浆和BALF上清中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β1、IgE等，操作按照试剂盒说明书进行，根据标准曲线计算出各细胞因子的浓度。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，数据采用表示。对各组不同时间之间先进行χ2正态分布和方差齐性检验，若符合正态分布和方差齐性，则采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间比较再采用LSD检验。若方差不齐两组之间比较采用Dunnett T3检验。相关性检验使用Pearson方法。取P＜0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 血液中炎症细胞含量变化 雾化吸入OVA引起的豚鼠(M组)过敏性支气管哮喘炎症在血液中的表现以嗜酸性粒细胞增多为主，其中2 h升高最为显著，持续24 h。然而雾化吸入1.0%抗IL-1β和TNF-α IgY(Z1组)在2～8 h，以及激素药物布地奈德混悬液(Z2组)在2、24 h降低血液中嗜酸性粒细胞数量。见表1。

表1 各组豚鼠血液中嗜酸性粒细胞比较(，%)Tab.1 Comparison of eosinophils in peripheral blood during different groups(，%)

表1 各组豚鼠血液中嗜酸性粒细胞比较(，%)Tab.1 Comparison of eosinophils in peripheral blood during different groups(，%)

Note:n.Numbers of guinea pig;1)comparation with group C，P ＜0.05;2)comparation with group M，P＜0.05.

Groups 2 h(n) 4 h(n) 8 h(n) 24 h(n)C 1.08±0.27(3)0.75±0.37(4)0.83±0.42(4)1.07±0.96(4)M 8.19±1.881)(5)2.36±0.371)(5)3.13±0.631)(5)2.31±1.321)(4)Z1 2.87±1.472)(4)0.74±0.932)(4)1.63±1.512)(5)1.19±0.87(5)Z2 1.63±0.522)(4)1.70±0.80(4)2.40±0.46(4)0.79±0.292)(4)

2.2 血浆及BALF中炎症细胞因子含量变化

2.2.1 血浆中炎症细胞因子含量变化 雾化吸入OVA的过敏性哮喘豚鼠(M组)血浆中炎症因子仅仅是 IL-16 在 2、4、24 h，TNF-α 在 24 h，TGF-β1 在4、8、24 h显著高于 C 组。而 IL-1β 在Z1 组4、24 h，IL-16 在 Z1 组2、4、24 h，TGF-β1 在 Z1 组4、8、24 h，以及IgE在Z1组24 h等显著低于M组(P＜0.05)。见表2。

表2 血浆中炎症因子含量变化()Tab.2 Content variation of inflammatory cytokines in plasma()

表2 血浆中炎症因子含量变化()Tab.2 Content variation of inflammatory cytokines in plasma()

Note:n.Numbers of guinea pig;1)comparation with group C，P ＜0.05;2)comparation with group M，P ＜0.05;3)comparation with group Z1，P＜0.05.

TimeGroups n IL-1β(pg/ml)IL-4(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)IL-13(pg/ml)IL-16(pg/ml)TNF-α(pg/ml)TGF-β1(pg/ml)IgE(ng/ml)147.27±199.50 211.43±14.35 M 4 18.97±2.53 137.23±23.33 4.61±3.00 41.69±11.80 19.64±6.05 27.33±5.44 1)281.35±14.92 13 996.66±265.49 237.52±27.32 Z1 4 62.34±87.26 205.16±58.28 4.81±1.93 56.53±15.24 7.50±1.66 17.75±4.582)264.68±11.68 14 417.57±5 202.91 278.24±21.21 Z2 4 53.27±19.28 466.52±428.81 4.71±2.22 86.52±57.84 17.59±18.8453.26±9.001)2)3)436.73±349.72 9 225.42±1 076.43 198.59±25.52 4 h C 4 14.70±1.45 319.45±232.62 4.11±2.71 60.52±36.91 19.59±23.46 12.24±3.21 340.19±246.06 11 194.94±10 29.68 262.98±102.79 M 4 18.29±2.07 125.14±26.01 4.62±1.31 40.12±8.43 8.64±1.81 27.85±3.871)272.72±13.65 14 413.86±332.581)268.92±39.34 Z1 4 8.74±1.921)2)246.76±131.04 3.66±1.01 33.82±9.15 7.55±1.11 8.50±2.152) 351.48±174.38 12 193.71±191.042)252.84±48.39 Z2 4 16.24±1.90 209.32±53.11 3.41±3.06 39.93±8.20 6.04±5.89 17.03±2.342)3)248.42±25.8113 969.72±1195.781)2)240.30±22.79 8 h C 4 12.73±5.06 202.78±32.81 1.96±1.95 41.95±17.40 9.81±5.31 21.21±17.60 213.48±26.41 10 914.63±688.72 252.13±62.09 M 4 17.28±2.32 126.40±18.381)4.17±2.01 41.10±18.66 9.33±2.43 29.84±5.47 274.58±23.99 14 259.20±240.671)263.94±32.95 Z1 4 14.91±6.93 131.79±29.26 2.77±1.98 36.92±10.71 9.23±3.71 25.67±12.27 228.89±67.45 10 077.51±890.042)364.63±129.12 Z2 4 6.95±4.971)151.76±88.58 1.04±1.162)37.94±17.68 4.55±1.85 22.10±11.03 160.55±71.402)8588.33±1037.981)2)3)142.52±76.492)24 h C 4 18.29±6.77 244.23±79.69 2.54±1.59 53.82±24.73 14.76±1.95 12.73±4.35 255.20±57.23 10 219.84±419.73 219.05±25.46 M 4 19.02±1.18 124.31±25.31 4.36±1.31 40.47±11.57 12.17±4.29 28.24±4.161)271.78±18.101)14 638.11±274.871)256.13±18.66 Z1 4 11.22±3.121)2)168.37±75.03 1.74±0.92 31.95±16.54 8.59±3.13 12.91±2.652)254.13±32.14 6 970.94±2723.032)170.85±29.101)2)Z2 4 13.10±4.70 274.19±102.29 2.46±1.45 53.96±18.51 10.75±1.49 14.24±3.462)444.58±365.40 7 889.74±933.661)126.71±52.021)2)2 h C 3 14.37±2.24 173.35±26.25 2.92±2.68 45.64±8.10 8.97±2.89 11.88±5.65 214.65±13.83 10

2.2.2 BALF中炎症细胞因子含量变化 雾化吸入OVA的过敏性哮喘豚鼠(M组)BALF中炎症因子 IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β1、IgE在2～24 h期间较C组显著增加(P＜0.05)。仅仅是IL-1β和TNF-α在 Z1组2～8 h显著低于M 组(P ＜0.05)。然而IL-4、IL-6、IL-8、IL-13在Z1组4～24 h，TGF-β 和 IgE 在 Z1组4～8 h，IL-16在 Z1组8 h等显著低于M组(P＜0.05)见表3。BALF中炎症因子有意义地变化是IL-1β和TNF-α首先降低，然后是其他因子下降，这表明过敏性炎症反应中IL-1β和TNF-α可能是始动因子。

表3 支气管肺泡灌洗液中炎症因子含量变化()Tab.3 Content variation of inflammatory cytokines in bronchoalveolar lavage fluid()

表3 支气管肺泡灌洗液中炎症因子含量变化()Tab.3 Content variation of inflammatory cytokines in bronchoalveolar lavage fluid()

Note:n:Numbers of guinea pig;1)comparation with group C，P ＜0.05;2)comparation with group M，P ＜0.05;3)comparation with group Z1，P＜0.05.

Time Group n IL-1β(pg/ml)IL-4(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)IL-13(pg/ml)IL-16(pg/ml)TNF-α(pg/ml)TGF-β1(pg/ml)IgE(ng/ml)±21.27 6.06±1.01 M 4 6.35±0.801)51.62±3.171)5.30±1.94 47.07±6.331)4.76±0.651)60.61±9.731) 65.13±1.301) 1 348.39±29.48 11.52±1.031)Z1 4 4.82±0.601)2)54.92±7.381)4.12±1.29 46.26±4.651)5.37±0.761)66.42±18.181)57.20±3.312) 1 365.39±60.531) 11.52±2.441)Z2 4 4.45±0.881)2)41.10±2.821)2)3)3.13±0.88 38.19±9.031)4.52±0.371)3)53.47±17.68 71.67±7.371)3)1 268.70±67.372) 10.51±0.671)4 h C 3 3.05±0.06 33.03±2.80 3.44±0.63 25.24±5.41 3.17±0.82 34.23±6.58 57.39±2.86 1 251.79±25.55 6.06±0.80 M 4 6.56±1.061)56.20±2.651)5.35±0.871)48.72±9.331)4.82±0.691)63.29±6.151) 63.30±3.04 1 365.28±31.171) 11.20±0.551)Z1 4 2.32±0.852)35.38±4.442)3.66±0.862)25.54±4.222)3.45±0.782)48.28±18.08 56.70±3.242) 1 208.34±11.892) 9.30±1.121)2)Z2 4 3.37±0.701)30.15±6.652)2.93±0.912)28.69±6.722)3)3.05±0.472)33.52±7.562) 48.34±3.662) 1 280.78±88.68 8.06±0.901)2)8 h C 4 3.64±0.93 34.47±5.56 3.17±9.86 24.26±5.58 3.24±0.23 31.70±8.31 51.61±3.04 1 232.46±43.24 6.63±1.06 M 4 6.28±0.661)50.16±4.281)5.18±0.911)48.72±8.301)4.49±0.551)58.60±3.871) 67.96±2.011) 1 329.07±33.711) 10.47±0.791)Z1 4 3.17±0.562)30.00±4.322)2.82±1.022)27.70±3.232)2.65±0.472)28.45±4.172)55.13±10.602)1 191.43±71.252) 7.32±1.102)Z2 4 1.28±0.651)2)3)29.49±2.572)1.65±0.841)2)22.31±6.682)2.58±0.371)2)30.39±10.352)54.44±9.572) 1 167.29±25.992) 7.02±1.382)24 h C 4 3.49±0.90 36.12±4.02 3.88±0.85 27.87±6.79 3.34±0.59 32.44±7.02 53.87±2.89 1 300.09±138.13 6.59±0.86 M 4 6.51±0.651)52.28±4.281)5.18±1.211)46.56±6.081)4.51±0.661)53.49±6.561) 61.74±4.671) 1 367.70±68.26 11.11±1.101)Z1 3 6.12±1.651)39.09±11.062)2.58±0.681)2)35.73±5.442)3.01±0.872)45.83±22.03 63.62±6.211) 1 416.00±303.08 9.46±1.971)Z2 4 3.75±0.972)3)37.44±11.032)3.23±0.761)2)32.63±7.572)2.46±0.492)3)35.91±4.552)70.54±5.691)2)3)1 191.44±14.492) 7.73±0.882)2 h C 3 3.16±0.79 32.35±3.67 3.54±1.38 27.37±3.63 3.15±0.21 39.46±5.26 56.72±2.80 1 280.77

2.3 血浆及BALF中炎症细胞因子相关性 在血浆中 IL-1β 与 IL-4、IL-8、IL-16、TNF-α 等呈正相关(P ＜ 0.05)，以及 TNF-α 与 IL-6、IL-16、TGF-β、IgE等呈正相关(P＜0.05)。在BALF中，IL-1β与IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β1、IgE 等呈正相关(P ＜0.05)，以及 TNF-α 与 IL-1β、IL-4、IL-8、IL-13、IL-16、IgE 等呈正相关(P ＜0.05)。

3 讨论

豚鼠经OVA致敏4次平滑肌收缩不断增强，攻击1小时BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞增加，直至24 h增加 3～44倍;TNF-α、IL-4、IL-5也增加［8-10］。我们现在与以往的研究［7］都证明雾化吸入OVA致敏和攻击的豚鼠出现典型的过敏性病理反应，并且现在也证明血液嗜酸性粒细胞增加，以及血液和BALF中Th2细胞因子及炎症因子升高。OVA诱导的哮喘模型大鼠血清IgE浓度升高，而每次激发之前30 min静脉注射 IL-1ra使之显著降低［6］。本文雾化吸入OVA致敏和攻击的豚鼠血液中以嗜酸性粒细胞显著增加为主，但在雾化吸入1.0%抗IL-1β和TNF-α IgY治疗后在2～8 h明显降低，且与布地奈德激素治疗组无显著性差异(见表1)。本文过敏性哮喘豚鼠血液中 IL-16、TNF-α、TGF-β 在不同时间点显著高于正常对照组，然而经1.0%抗IL-1β 和 TNF-α IgY 治疗后 IL-1β、IL-16、TGF-β 和IgE等在不同时间点显著低于M组，且与布地奈德激素治疗组相似(见表2)。本文豚鼠模型为雾化吸入OVA致敏和攻击模型，气道和肺泡等肺组织以局部过敏反应为主，这可能更符合吸入性过敏反应的患者的实际情况，因此豚鼠血液中炎症细胞数量和炎症细胞因子变化较其他学者采用的皮下或腹腔注射OVA全身过敏性反应模型不同，后者血液中炎症细胞数量和炎症细胞因子变化更为显著。

OVA致敏/攻击的豚鼠 BALF中 TNF-α、IL-4、IL-5和嗜酸性粒细胞升高［8］，攻击1 h嗜酸性粒细胞、中性粒细胞就增加，24 h嗜酸性粒细胞增加3～44倍，而中性粒细胞下降至正常［9］。布地奈德吸入均可抑制OVA致敏/攻击的豚鼠BALF中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞，以及 TNF-α、IL-4、IL-5的增加［9］。OVA致敏/攻击的小鼠静脉注射抗TNF-α抗体(Infliximab)后BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、TNF-α、IL-6 减少［3］，而腹腔注射可溶性 TNF 受体(sTNFR)也减少了BALF中嗜酸性粒细胞、IL-4、IL-5、IL-13［4］。OVA 攻击大鼠前 30min 静脉注射IL-I受体拮抗剂(IL-1ra)其BALF中嗜酸性粒细胞百分比下降［6］。本文豚鼠雾化吸入OVA后BALF中 IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β1、IgE在2～24 h期间显著增加(M组)，但有趣的是1.0%抗IL-1β和TNF-α IgY抗体雾化吸入治疗后BALF中炎症因子IL-1β和TNF-α首先下降(2 h)，而其他Th2细胞因子和炎症因子，如IL-4、IL-6、IL-8、IL-13 则在4～ 24 h，TGF-β、IgE 在4～8 h，IL-16在8 h期间显著下降;当IL-1β和TNF-α在24 h上升时，而 IL-4、IL-6、IL-8、IL-13在24 h仍显著下降;并且 IL-1β 与 IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β1、IgE，以及 TNF-α 与 IL-1β、IL-4、IL-8、IL-13、IL-16、IgE等呈正相关。这一现象初步证明IL-1β和TNF-α是过敏性哮喘免疫效应阶段炎症发生、发展的始动炎症因子。其他学者的研究也证明IL-1β加入气管培养中刺激气管上皮细胞表达IL-1R1和TNFR1及平滑肌细胞表达TNFR1增加，并仍可刺激气管上皮细胞及平滑肌细胞本不表达的TNFR2表达［11］。IL-1β 增加 TNF-α mRNA 在气管中的表达，而抗TNF-α抗体显著抑制了IL-1β诱导的缓激肽B1和B2受体在气道平滑肌上表达［3］，这也证明IL-1β可能在炎症发展过程中出现在TNF-α之前。

本研究还证明抗IL-1β和TNF-α IgY雾化吸入治疗OVA诱导的过敏性哮喘豚鼠的疗效与布地奈德治疗无显著差异(见表1～3)。这一结论可能有利于抗IL-1β和TNF-α IgY雾化吸入治疗过敏性哮喘患者，因为特异性IgY被动免疫治疗可以达到良好的局部治疗的效果，同时不引起像激素治疗所产生的全身不良反应等毒副作用。事实上，一项长达十年的特异性抗绿脓杆菌IgY口服预防肺囊性纤维化患者绿脓杆菌感染的试验证明，IgY治疗未见毒副作用，且疗效明确［12］。本研究还提示，抗 IL-1β和TNF-α IgY抗体雾化吸入局部治疗可能是一种新的有效治疗过敏性哮喘的手段和途径。

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