CD59促进LAT介导的T细胞活化①

高美华 李园园 王丽娜 丛蓓蓓 王 冰 张 蓓 李 营 梁 洁

(青岛大学医学院免疫学教研室，青岛 266071)

CD59相对分子量18～20 kD，其基因定位于人类第11号染色体短臂上，配体为CD2。广泛表达于人外周血白细胞、红细胞和其他多种细胞，缺乏胞内段，通过棕榈酰基团锚固于细胞膜。细胞活化后CD59分子被募集于细胞膜脂筏(Lipid rafts)区域。CD59抗体在共刺激信号存在下可诱导T淋巴细胞早期活化，引起后期胞内信号分子的级联反应［1］。但CD59分子缺乏跨膜区和胞内区，无法直接向胞内传递信号，其功能的发挥可能通过非特异性跨膜蛋白或接头蛋白得以实现。LAT分子量为36～38 kD，主要表达于T细胞、NK细胞、肥大细胞和血小板。LAT分子是T细胞活化的重要接头分子，经棕榈酰化后进入脂筏传递细胞活化信号［2］。LAT分子本身不含棕榈酸基团，但在靠近细胞膜的胞内区有2个棕榈酰化位点(C26，C29)。本课题前期已证实CD59能使LAT分子进入脂筏［3］。本研究先构建LAT-GFP融合蛋白，以逆转录病毒为载体转染Jurkat细胞，建立稳定转染细胞系Jurkat-GFP。将pSU-PER-siCD59干扰质粒导入Jurkat-GFP细胞下调CD59表达，并利用CD59单克隆抗体刺激Jurkat-GFP细胞。重点研究下调CD59分子的表达及使用抗体活化CD59分子对细胞增殖及细胞信号转导通路中信号分子活化水平的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 LAT-GFP逆转录病毒载体由上海吉凯公司构建。Jurkat细胞、pSUPER-siCD59干扰质粒和大肠埃希菌JM109由本实验室提供。兔抗人CD59单抗(mAb)购于Abcam。TRITC标记山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG购于北京康为。兔抗人LCK抗体购于Abgent。兔抗人ZAP70磷酸化单抗及兔抗人PLCr1抗体购于Abcam。兔抗人ZAP70抗体、兔抗人PLCr1磷酸化抗体和兔抗人LCK磷酸化抗体均购于上海生工。兔抗人beta-Actin单克隆抗体购于中杉金桥。电转仪ECM830购于美国BTX公司。激光共聚焦显微镜OLYMPUS FLUOVIEW FV1000购于日本公司。

1.2 方法

1.2.1 Jurkat细胞系的培养与传代 Jurkat细胞接种于含10%胎牛血清(ExCell)1%双抗(105U/L青霉素、105U/L链霉素)RPMI1640培养基的细胞培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中培养，根据其细胞密度每2～3 d换液或传代。

1.2.2 LAT-GFP稳定表达细胞系的建立 LATGFP逆转录病毒由上海吉凯公司合成。按Lentiviral Vector Particle，收集处于对数生长期的正常Jurkat细胞，以5 000 cell/孔接种96孔板，按MOI值为100加入逆转录病毒。转染后48 h(1 μg/ml)嘌呤霉素筛选，转染后96 h观察融合蛋白荧光表达。筛选后细胞扩大培养。

1.2.3 pSUPER-siCD59干扰质粒转染LAT-GFP细胞 pSUPER-siCD59干扰质粒转染感受态大肠杆菌，挑取单克隆，液体培养基扩大培养。按EndoFree Plasmid ezFlow Maxiprep Kit(BIOMIGA)，抽提质粒。收集对数生长期LAT-GFP细胞，调节细胞浓度为4 ×106个/ml。取 250 μl细胞悬液与 50 μl质粒加入4 mm电转杯(BTX)，混匀，冰上孵育15 min，按300 V，10 ms电击。电击完成后将电转杯置冰上孵育15 min，转入含20%血清PBS离心管中离心，加入完全培养基重悬于24孔板，细胞培养箱继续培养。转染后24 h(4 mg/ml)G418筛选阳性细胞，48 h观察荧光表达。

1.2.4 激光共聚焦显微镜检测CD59抗体作用前后，LAT和CD59在各组细胞细胞膜上的分布 实验分两种处理。一组细胞固定后加CD59抗体，观察相对静止状态下CD59与LAT的分布。方法为细胞离心后PBS洗涤，调整细胞密度滴于黏附载玻片，涂成单细胞层，晾干。4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS洗3次，每次5 min。10%山羊血清室温封闭30 min，轻轻甩去封闭液，加入兔抗人CD59一抗。湿盒4℃过夜孵育后轻轻甩去一抗稀释液，加入罗丹明标记二抗。室温避光孵育2 h后PBS洗3次，每次5 min，70%甘油封闭，立即共聚焦激光显微镜观察。另一组预先用CD59一抗刺激细胞再固定，观察抗体活化后CD59和LAT分子的分布。方法为细胞离心后，基础培养基重悬，加入兔抗人CD59一抗，室温低速摇床2 h，PBS洗涤2次，每次5 min，加入罗丹明标记二抗，室温低速摇床1 h，PBS洗3遍，每次5 min。涂于玻片上，室温晾干，70%甘油封片，共聚焦激光显微镜观察。

1.2.5 MTT检测各组细胞增殖率 取对数生长期细胞，按1×105个/孔，接种于96孔板，每组设3个平行复孔。其中抗体活化组加入CD59抗体10 μg/孔，细胞培养箱中培养12 h。加入MTT(5 mg/ml)10 μl/孔，37℃ 孵育 4 h，离心去上清，加入 DMSO 150 μl/孔，室温低速振荡10 min使结晶完全溶解。采用全自动酶标检测仪于490 nm处测定各组吸光光度(A)值。

1.2.6 Western blot检测CD59的表达水平及相关信号转导分子磷酸化水平 收集对数生长期各组细胞1×107个，提取总蛋白。SDS-PAGE电泳后转膜，5%脱脂奶粉室温低速摇床封闭2 h，加入一抗4℃摇床过夜孵育。TBST漂洗3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温摇床孵育2 h。TBST洗3次，每次10 min。加入显色液，室温避光孵育5 min，曝光拍照。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件分析处理实验数据，以表示。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光显微镜下荧光表达 逆转录病毒转染Jurkat细胞(MOI=100)，转染后72 h出现荧光，荧光表达于细胞膜，转染后96 h荧光表达最强，继续培养荧光稳定表达(图1A);pSUPER-siCD59干扰质粒转染Jurkat-GFP细胞，转染后24 h出现绿色荧光，荧光表达于胞浆和胞膜(图1B)。

2.2 激光共聚焦显微镜下CD59抗体活化前后，LAT分子和CD59分子在细胞膜上的定位 细胞预先用多聚甲醛固定再加CD59抗体可视为自然状态下CD59和LAT的分布，CD59分子红色标记，LAT分子用绿色荧光标记。图2A为静止状态下Jurkat-GFP细胞中CD59和LAT分子在细胞膜的分布，可见绿色荧光和红色荧光在细胞膜上弥散存在，未见明显点状聚集;图2B为转染pSUPER-siCD59干扰质粒的Jurkat-GFP细胞，可见细胞质和细胞膜均表达绿色荧光，红色荧光只表达于细胞膜但荧光强度较为转染质粒组明显变弱，说明CD59分子在干扰质粒作用下表达量降低;图2C中Jurkat-GFP细胞先加CD59抗体刺激后再固定，可用于观察细胞经CD59分子活化后CD59和LAT分子在细胞膜的定位。镜下可见，绿色荧光与红色荧光在细胞膜上呈点簇状分布，局部区荧光叠加。

图1 荧光显微镜下细胞荧光分布(×100)Fig.1 Distribution of fluorescence on transfected cells(×100)

2.3 MTT结果 与正常Jurkat-GFP细胞相比，转染干扰质粒后Jurkat-GFP细胞增殖速率明显降低(PAB＜0.05)，而CD59活化后Jurkat-GFP细胞增殖速率显著增高(PAC＜0.05)，见图3。

2.4 Western blot检测各组细胞中细胞活化相关磷酸化蛋白水平的变化 PLCr1、ZAP70、LCK蛋白的总体表达水平在三组细胞中差异不明显(P＞0.05)，但其磷酸化水平存在明显差异。转染干扰质粒组细胞蛋白的磷酸化水平低于空白对照组，抗体活化组细胞蛋白磷酸化水平最高，差异均有统计学意义(PAB＜0.05，PAC＜0.05，PBC＜0.05)，见图4。

图2 CD59分子与LAT分子在细胞膜的表达分布Fig.2 Expression and distribution of CD59 and LAT on different cells membrane

图4 Western blot检测各组细胞蛋白及其磷酸化水平Fig.4 Total/phoshorylation protein levels of different groups by Western blot

图3 不同处理组CD59分子对细胞增殖的影响Fig.3 Proliferation of three cell groups

3 讨论

CD59分子即糖基磷脂酰肌醇锚固蛋白，是Ly-6超家族成员之一。作为细胞免遭补体溶解的重要的同源限制因子，通常认为CD59分子通过阻断C9与C5-8复合体的结合而抑制膜攻击复合物(Membrane attact complex，MAC)的形成，从而保护细胞不被裂解［4，5］。此外，CD59 分子在信号转导中也发挥重要作用，研究表明CD59抗体交联后可以募集ZAP70、Lyn和SFKs等进入脂筏，刺激IL-2的分泌和Ca2+的释放［6-9］。LAT分子可分为胞外区、跨膜区和胞浆区三部分，其胞浆区含有10个络氨酸残基，5个络氨酸与Grb2的SH2结合，5个络氨酸与PLCr的SH2结合。LAT分子可被SYK家族激酶中的ZAP70磷酸化，并与Grb2、Gads和PLCr1结合，从而启动信号转导过程中的Ca2+内流和Ras丝裂原活化的蛋白激酶途径(Ras-MAPK)［10，11］。

我们针对CD59和LAT分子的功能和结构特点，对其在信号转导中的相关性进行研究。该实验以携带有LAT-GFP融合蛋白的逆转录病毒为工具并利用CD59荧光标记抗体，实现对两个分子的可视化研究。免疫荧光显示，CD59抗体刺激Jurkat-GFP细胞后，细胞膜上LAT分子由弥散分布转为点簇状聚集并与CD59分子共同定位于脂筏区域，这与先前的研究结果是一致的［3，4］，据此我们推测，活化后CD59分子对LAT分子募集入脂筏具有促进作用。MTT结果表明，抗体活化组细胞的增殖水平明显高于空白对照组，而质粒转染组细胞增殖速率最慢(P＜0.05)，提示CD59分子抗体刺激后可能引起Jurkat细胞的活化。此外研究表明，T淋巴细胞活化后LAT分子可能作用于胞内的Grb2、PLCr1、Cbl等下游信号分子，介导 T淋巴细胞胞内信号的传导［12］，因而我们利用Western blot对其活化信号通路的下游分子进行检测，结果显示:与空白对照组相比，质粒转染组和抗体活化组 ZAP-70、PLCr-1和LCK总蛋白表达无明显差异(P＜0.05)，但磷酸化蛋白表达有显著差异(P＜0.05)，其中抗体活化组蛋白磷酸化水平最高，空白对照组次之，CD59干扰组的蛋白磷酸化水平最低。

Lin等人［13］的研究发现LAT分子的胞外区和穿膜区不是LAT分子进入脂筏介导一系列胞内效应的唯一结构。进一步地研究证实，LAT分子其结构在胞内区近细胞膜的位置有两个半胱氨酸保守区(C26，C29)，作为其棕榈酰化位点，该位点突变后LAT分子无法被棕榈酰化，进而不能被募集入脂筏。因此，我们猜想CD59分子可能提供了活化LAT分子的棕榈酸基团，从而诱导T淋巴细胞的活化作用。其机制可能与分子间棕榈酸基团的转移有关:CD59分子由103位氨基酸组成，其N端含单一的糖基化位点，而C端通过棕榈酸基团与细胞锚连。由于其缺乏胞内段，故不能向细胞内直接传递信号，必须通过一个接头分子才可将活化信号传至胞内。LAT分子是T细胞活化的接头信号分子，可把胞外活化信号传导至胞内，活化Ras信号转导途径，最终引起胞内Ca2+的释放，诱导细胞内NF-AT的转录。

综上所述，CD59抗体活化后，CD59和LAT分子可产生明显聚集现象并共定位于胞膜，还可以引起信号转导通路的下游磷酸化蛋白表达增高，从而更进一步地证实活化CD59分子可能促进LAT介导的T细胞信号转导。更为重要的是，对CD59分子在细胞信号通路中的研究可为推测其他GPI-APs与细胞信号转导通路的相关性研究提供有力依据，并为CD59分子在肿瘤机制研究中奠定了坚实的基础，这对于今后肿瘤疾病的靶向治疗具有重要的意义。

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