T细胞亚群偏移与雌激素缺乏骨丢失相关性实验研究①

高秀莲 邢美云 王 丽 郭钰琪 周宪宾 张巧凤 张洪海 姚成芳 姜国胜 李 霞

(山东省医学科学院基础医学研究所肿瘤免疫与中药免疫重点实验室，济南 250062)

正常骨代谢是成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨丢失之间的平衡过程，骨代谢失衡将导致骨疾病的发生［1］。已证实雌激素参与了骨代谢过程，雌激素缺乏状态下骨丢失加速，易导致骨质疏松、骨折等骨代谢性疾病，严重影响患者健康，但其发病机理尚未完全阐明。目前治疗主要采用雌激素替代疗法，取得一定疗效，但存在诱发子宫内膜癌、宫颈癌、乳腺癌、代谢紊乱等危险，因此临床亟待开发防治雌激素缺乏骨丢失疗效确切且副作用小的药物与方法。随着系统医学研究不断深入，证实机体骨代谢系统与内分泌系统、免疫系统之间存在着密切联系，三者形成内分泌-免疫-骨代谢调节网络，在骨代谢过程发挥着复杂而精细的调控作用［2］。T细胞是免疫调节的主体，Th17、Treg亚群的发现使经典的Th1/Th2模式扩展为Th1/Th2/Th17/Treg模式［3］。不同T细胞亚群产生特异性细胞因子，在机体抵抗病原体感染、维持机体免疫内环境稳定中发挥着重要作用，其亚群失衡参与了多种自身性免疫疾病及代谢性疾病的发生，但其在雌激素缺乏骨丢失中的作用尚未明确［4］。本研究通过建立雌激素缺乏骨丢失小鼠动物模型，观察雌激素缺乏状态下Th1/Th2/Th17/Treg亚群偏移状态，探讨其与雌激素缺乏骨丢失的相关性，以期进一步揭示雌激素缺乏骨丢失的发病机制，为临床治疗提供新的靶点与途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雌性BALB/c小鼠，由北京维通利华有限公司提供，鼠龄10周，体重(22±2)g，置于室温24℃，相对湿度60%～65%的超净动物饲养柜内，给予12 h光照，12 h暗室，自由饮水摄食。

1.2 主要试剂 大鼠抗小鼠荧光抗体:PC5-CD25、FITC-CD4、PE-TNFα、PE-IL-4、PE-IL-17A、PE-Foxp3均购自美国BD Pharmigen公司;雌二醇ELISA试剂盒购自美国R＆D公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 30只BALB/c小鼠随机分为正常组、假手术组及卵巢切除组，各10只。

1.3.2 动物处理 小鼠禁食12～18 h，10%水合氯醛注射液按100 mg/kg剂量腹腔注射麻醉，卵巢切除经腹腔行常规手术切除双侧卵巢，假手术组不切除卵巢，仅切除卵巢周围与卵巢等大的脂肪组织。术后自由进食水，12周后进行指标检测。

1.3.3 标本收集 末次给药后1 h小鼠眼球取血，颈椎脱臼处死，分离血清，ELISA法检测E2水平;无菌分离脾脏，200目铜网研磨过滤，冷PBS冲洗，Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，用于流式胞内外因子双染色检测;取右侧股骨，剔除软组织，用于BMD检测。

1.3.4 ELISA法检测血清E2水平 按ELISA试剂盒操作说明测定血清E2。

1.3.5 骨密度测定 双能X射线骨密度仪测量小鼠股骨前后位BMD。

1.3.6 流式抗体标记与检测 收集脾脏单个核细胞(1×106/管)，加入大鼠血清，室温避光孵育30 min。将外标抗体(FITC-CD4、PC5-CD25)按说明书分别加入到细胞悬液中，4℃避光孵育30 min。冷1×PBS 洗2次;去上清，加入100 μl固定液，4℃避光孵育30 min。冷1×PBS洗1次，加入100 μl穿膜液重悬细胞，将内标抗体(PE-TNFα、PE-IL-4、PEIL-17A、PE-Foxp3)加入细胞悬液中，4℃避光孵育12 h。加入1 ml穿膜液洗1次，去上清，冷1×PBS洗2次，1×PBS重悬细胞，转管，上机检测。采用Winmidi 2.9分析Th1亚群(CD4+TNFα+)、Th2亚群(CD4+IL-4+)、Th17亚群(CD4+IL-17A+)及Treg亚群(CD4+CD25+Foxp3+)比例。

1.4 统计学处理 应用SPSS11.5软件分析，计量资料以表示，采用One Way-ANOVA方差分析，数据间相关性用Pearson相关性分析，相关系数(r值)为正，表示正相关，r值为负，表示负相关，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清E2水平比较 与正常组及假手术组比较，卵巢切除组小鼠E2水平显著降低(P＜0.05)，证实雌激素缺乏小鼠模型建立成功，见图1。

2.2 各组小鼠骨密度比较 与正常组及假手术组比较，卵巢切除组小鼠股骨骨密度显著降低(P＜0.05);假手术组与正常组小鼠比较，股骨骨密度无显著性差异;证实雌激素缺乏状态导致骨丢失，见图2。

2.3 各组小鼠Th1/Th2亚群比例变化 与正常组及假手术组比较，卵巢切除组小鼠脾脏单个核细胞Th1亚群比例显著升高(P＜0.05)，Th2亚群比例显著降低(P＜0.05)，Th1/Th2比值明显升高(P＜0.05)，提示雌激素缺乏骨丢失状态存在Th1/Th2亚群向Th1偏移现象，见图3。

2.4 各组小鼠Th17/Treg亚群比例变化 与正常组及假手术组比较，卵巢切除组小鼠脾脏单个核细胞Th17亚群比例显著升高(P＜0.05)，Treg亚群比例显著降低(P＜0.05)，Th17/Treg比值明显升高(P＜0.05)，提示雌激素缺乏骨丢失状态存在Th17/Treg亚群向Th17偏移现象，见图4。

图2 股骨骨密度比较Fig.2 Comparison of BMD of thigh bone

图3 Th1/Th2亚群比例变化Fig.3 Paradigm of Th1/Th2 subsets

2.5 E2、骨密度、T细胞亚群相关性分析 相关性分析显示E2水平与骨密度、Th2亚群比例、Treg亚群比例呈显著正相关(P＜0.05)，与Th1亚群比例、Th17亚群比例呈显著负相关(P＜0.05);骨密度与Th1、Th17亚群比例呈显著负相关(P＜0.05)，与Th2、Treg亚群比例呈显著正相关(P＜0.05)，见表1。相关性结果提示T细胞亚群在维持正常骨代谢过程中发挥着重要作用，雌激素缺乏导致的T细胞亚群失衡状态可能在骨丢失中扮演了重要角色，靶向逆转T细胞亚群失衡的方法可能成为减轻雌激素缺乏骨丢失的有效途径。

图4 Th17/Treg亚群比例变化Fig.4 Paradigm of Th17/Treg subsets

表1 E2、骨密度、T细胞亚群比例相关性Tab.1 Correlation analysis of E2，BMD and paradigm of T-cell subsets

3 讨论

雌激素缺乏导致的骨质疏松症等骨代谢疾病严重危害患者健康，给家庭、社会带来沉重负担，成为世界范围内日益受到关注的健康问题。目前西医治疗雌激素缺乏骨丢失相关疾病主要采用雌激素替代疗法，但存在诱发子宫内膜癌、宫颈癌、乳腺癌风险及代谢紊乱等副反应。因此，进一步阐释雌激素缺乏导致骨丢失的机制，将为寻找预防或治疗雌激素缺乏骨丢失疗效确切、副作用小的方法与药物提供科学依据。

随着系统研究的不断深入，证实内分泌系统、免疫系统和骨代谢系统间存在密切联系，三个系统间共享多种调控分子，包括细胞因子、转录因子、受体及信号分子等，一个系统的生理病理状态不可避免地影响另一个系统［5］。雌激素是重要的性激素，T细胞是机体免疫系统中重要的细胞群体，雌激素-T细胞-骨代谢三者的关系成为目前本领域研究的热点。已证实T细胞上存在雌激素受体，雌激素水平变化可直接影响T细胞增殖、活化和亚群极化，雌激素缺乏可诱导T细胞向Th1漂移，导致T细胞亚群极化失衡［6］。正常小鼠去卵巢后发生骨质疏松，而裸鼠去卵巢后骨量并未丢失，提示雌激素诱导的T细胞亚群极化状态对骨代谢有重要调节作用［7］，但雌激素缺乏对T细胞亚群(Th1/Th2/Treg/Th17)极化的影响在雌激素缺乏导致的骨丢失中究竟发挥着怎样的作用尚缺乏系统研究。

初始T细胞遇抗原刺激后在特异性核转录因子与分化诱导因子作用下，分化为Th1/Th2/Th17/Treg等亚群，分泌特征性细胞因子，主导不同的免疫反应。Th1、Th2是经典的 T细胞亚群，Th1/Th2亚群平衡在维持正常骨代谢中具有重要作用。Th1亚群产生TNFα等促骨吸收因子，能诱导破骨细胞形成，促进骨吸收作用［8］。Th2类细胞因子产生IL-4等细胞因子，抑制 NF-κB的受体活化配基(RANKL)诱导的生理性骨吸收和TNFα诱导的破骨细胞生成与成熟，进而抑制骨吸收，减少骨丢失［9］。Th17和Treg产生于同一前体细胞，分化过程受多种相同诱导因子及转录因子调控，Th17/Treg亚群平衡在维持正常骨代谢中发挥着重要作用［10］。Th17通过产生IL-17A等细胞因子介导炎症反应，在机体防御病原微生物感染中发挥重要作用，但其过度表达则可造成机体组织损伤［11］。有研究报道雌激素缺乏状态能诱导分泌IL-17的Th17亚群，进而促进破骨细胞活化，提示Th17在雌激素缺乏导致的骨丢失中扮演了重要角色［12］。Treg高表达CD25，Foxp3是其特异性核转录因子，Treg通过产生TGF-β等细胞因子或通过细胞间直接接触发挥免疫抑制与调节作用，能够通过抑制破骨细胞功能减少骨丢失［13］。

我们的前期研究发现，雌激素缺乏导致的骨丢失状态存在着Th1类细胞因子TNFα表达升高［14］，提示T细胞亚群偏移可能参与了雌激素缺乏骨丢失的过程。本研究发现，去卵巢小鼠雌激素水平显著降低，同时骨密度显著下降，E2水平与骨密度呈显著正相关，证实雌激素缺乏状态导致骨丢失。同时，我们发现，雌激素缺乏状态下，Th1、Th17亚群比例显著升高，Th2、Treg亚群比例显著降低，T细胞平衡向Th1、Th17亚群偏移。相关性分析显示E2水平及骨密度均与Th1、Th17亚群比例呈显著负相关，与Th2、Treg亚群比例呈显著正相关，提示雌激素缺乏诱导的T细胞亚群失衡参与了骨丢失过程，靶向逆转T细胞亚群失衡的方法可能成为减轻雌激素缺乏骨丢失的有效途径。本研究进一步阐释了雌激素缺乏骨丢失的发病机制，为靶向逆转雌激素缺乏导致的T细胞亚群失衡状态减轻骨丢失提供了实验依据，但雌激素缺乏状态T亚群分化失衡影响破骨细胞与成骨细胞分化与功能的确切分子机制仍需进一步深入探讨。

［1］Walsh MC，Kim N，Kadono Y，et al.Osteoimmunology:interplay between the immune system and bone metabolism［J］.Annu Rev Immunol，2006，24:33-63.

［2］Luo CY，Wang L，Sun C，et al.Estrogen enhances the functions of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+)regulatory T cells that suppress osteoclast differentiation and bone resorption in vitro［J］.Cell Mol Immunol，2011，8(1):50-58.

［3］Peck A，Mellins ED.Plasticity of T-cell phenotype and function:the T helper type 17 example ［J］.Immunology，2009，129:147-153.

［4］Li CR，Mueller EE，Bradley LM.Islet antigen-Specific Th17 cells can induce TNF-α-dependent autoimmune diabetes［J］.J Immunol，2014，192(4):1425-1432.

［5］D＇Amelio P.The immune system and postmenopausal osteoporosis［J］.Immunol Invest，2013，42(7):544-554.

［6］Priyanka HP，Krishnan HC，Singh RV，et al.Estrogen modulates in vitro T cell responses in a concentration-and receptor-dependent manner:effects on intracellular molecular targets and antioxidant enzymes［J］.Mol Immunol，2013，56(4):328-339.

［7］Cenci S，Weitzmann MN，Roggia C.Estrogen deficiency induces bone loss by enhancing T cell production of TNF-alpha［J］.J Clin Invest，2000，106:1229-1237.

［8］Kotake S，Nanke Y.Effect of TNFα on osteoblastogenesis from mesenchymal stem cells［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1840(3):1209-1213.

［9］Fujii T，Kitaura H，Kimura K et al.IL-4 inhibits TNF-α-mediated osteoclast formation by inhibition of RANKL expression in TNF-αactivated stromal cells and direct inhibition of TNF-α-activated osteoclast precursors via a T-cell-independent mechanism in vivo［J］.Bone，2012，51(4):771-780.

［10］Komatsu N，Okamoto K，Sawa S，et al.Pathogenic conversion of Foxp3(+)T cells into TH17 cells in autoimmune arthritis［J］.Nat Med，2014，20(1):62-68.

［11］Rychlewska-Hańczewska A，Adamski Z.Role of Th17 lymphocytes in pathogenesis of colorectal cancer［J］.Postepy Hig Med Dosw(Online)，2014，68:42-47.

［12］Zwerina K，Koenders M，Hueber A，et al.Anti IL-17A therapy inhibits bone loss in TNF-α-mediated murine arthritis by modulation of the T-cell balance ［J］.Eur J Immunol，2012，42(2):413-423.

［13］Luo CY，Wang L，Sun C，et al.Estrogen enhances the functions of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+)regulatory T cells that suppress osteoclast differentiation and bone resorption in vitro［J］.Cell Mol Immunol，2011，8(1):50-58.

［14］李 霞，孙建丽，王 彬，等.绝经妇女外周血单个核细胞骨代谢调控因子表达变化［J］.中国免疫学杂志，2011，8(11):49-53.