姜黄素下调胸腺基质淋巴细胞生成素表达及功能的研究①

高明春 郝成欣 高志玲 刘大伟 高晓霞 (吉林省白城医学高等专科学校，白城137000)

特应性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一种慢性、复发性炎症性皮肤病，主要表现为剧烈的瘙痒、明显的湿疹样变和皮肤干燥[1]，其发生发展过程涉及多种细胞，如肥大细胞、树突状细胞、上皮细胞、嗜酸性粒细胞及T细胞等。近年来，随着对特应性皮炎直接相关的效应细胞及效应分子研究的深入，逐步明确肥大细胞在特应性皮炎炎症过程中迁移、聚集、局部数量增多的机制[2]。众多研究表明，在AD动物模型中，大量肥大细胞被激活并浸润到皮肤破损处，从而表明了肥大细胞在AD中的作用[3]。肥大细胞的激活能产生大量的胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)。研究证明，特应性皮炎患者皮损处的角质形成细胞高度表达TSLP[4]。此外，TSLP还能显著提高 CD11c+树突状细胞的成熟，从而促进幼稚CD4+T细胞朝Th2细胞的分化，增强皮肤或全身的Th2反应[5]。由于上述过程均与炎症反应密切相关，而大量的研究报道称姜黄素具有抗炎及抗氧化活性[6，7]。因此，本研究主要观察姜黄素在肥大细胞系HMC-1细胞中对TSLP表达的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株及实验试剂 人肥大细胞系HMC-1购自于广州吉妮欧生物科技有限公司。细胞培养采用含10%胎牛血清的IMDM(美国Gibco公司)培养基(内含100 U/ml的青霉素和链霉素)。佛波酯(PMA)，A23187及姜黄素购自 Sigma公司。Caspase-1活性检测试剂盒购自 R＆D公司。人TSLP抗体、NF-κB p65抗体及细胞核蛋白抽提试剂盒购自于碧云天公司。

1.2 TSLP的ELISA检测 以每孔4×105个HMC-1细胞密度铺板，37℃、5%CO2孵箱培养过夜，经0.5～5 μmol/L浓度的姜黄素刺激2 h后，加入PMA与A23187刺激7 h，离心收集上清液，采用夹心ELISA方法来检测培养上清液中的TSLP水平。详细步骤可参照说明书。

1.3 TSLP mRNA的定量RT-PCR检测 以每孔1×106个HMC-1细胞密度铺板，培养过夜，经0.5～5 μmol/L浓度的姜黄素刺激2 h后，加入PMA与A23187仅刺激5 h(mRNA表达高峰比蛋白出现早)，收集细胞并采用qRT-PCR法来检测TSLP mRNA的表达。采用Trizol试剂(Invitrogen公司)来提取收集的各组HMC-1细胞中的总RNA，并逆转录获得cDNA(TaKaRa公司)。采用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司)对TSLP mRNA表达情况进行检测，β-actin作为内参。引物均为上海生物工程有限公司合成，序列如下:人TSLP(上游5'-TGGGTGTCCACGTATGTTCC-3';下游5'-CGGTACTTTTGGTCCCACTCA-3')及人 β-actin(上游 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3';下游5'-CCTTCTGCATCTGTCGGCA-3')，扩增产物大小分别为197 bp和275 bp。利用ABI PRISM7300快速实时PCR系统进行PCR反应:先预变性95℃ 30 s，然后以95℃ 5 s，60℃ 31 s的条件进行40个PCR循环反应。采用2-△△Ct法对TSLP mRNA的相对表达量进行计算。

1.4 NF-κB p65的Western blot检测 与ELISA 检测TSLP蛋白刺激方法相同，收集各组HMC-1细胞，用细胞核蛋白抽提试剂盒提取核蛋白，蛋白浓度采用Bradford方法测定，蛋白行12%SDS-PAGE凝胶电泳，然后转移到PVDF膜上 (北京鼎国生物技术有限公司)，以含有5%脱脂奶粉的PBST封闭1 h后，兔抗人 NF-κB p65 一抗(1∶1 000)孵育 4℃ 过夜，二抗(羊抗兔1∶5 000)室温孵育1 h，ECL显影(碧云天生物技术有限公司)，曝光。以β-actin作为内参。应用Bio-Rad成像系统对条带进行灰度扫描，半定量分析细胞核内NF-κB p65的表达水平，从而来反映各组NF-κB的活化情况。

1.5 caspase-1活性的检测 以每孔5×106个HMC-1细胞密度铺板，37℃、5%CO2孵箱培养过夜，经0.5～5 μmol/L浓度的姜黄素刺激2 h后，加入PMA与A23187刺激1 h，最后离心收集细胞。采用caspase-1活性检测试剂盒进行检测，按照说明书操作。主要过程是向收集的细胞中加入冷的裂解缓冲液，冰上裂解15 min，12 000 r/min离心10 min，收集上清。然后在每个裂解上清中加入80 μl的检测缓冲液及10 μl的 Ac-YVAD-pNA，37℃下孵育 2 h，最后测定A405值。

1.6 统计学分析 实验数据均采用SPSS16.0软件进行统计分析，实验数据采用±s表示，组间比较采用T检验和方差分析，P＜0.05为组间有显著性差异。

2 结果

2.1 姜黄素对HMC-1细胞中TSLP因子表达的影响 通过ELISA方法检测刺激上清液中的TSLP，结果发现PMA联合A23187能刺激HMC-1细胞中TSLP表达的上调。而不同浓度的姜黄素均能在一定程度上降低由PMA和A23187诱导的TSLP水平，尤其以50 μmol/L姜黄素最为显著(见图1，P＜0.05)，最大的抑制率能达到(29.5±5.3%)。

2.2 姜黄素对HMC-1细胞中TSLP mRNA表达的影响 通过定量RT-PCR的方法分析TSLP mRNA的表达，结果发现PMA联合A23187能刺激TSLP mRNA表达的上调。而不同浓度的姜黄素均能在一定程度上降低由PMA和A23187诱导的TSLP mRNA水平(图2)，且50 μmol/L姜黄素的抑制效果大于0.5和5 μmol/L(P ＜0.05)。

2.3 姜黄素对HMC-1细胞中NF-κB p65活化的影响 通过Western blot来检测细胞核中NF-κB p65的表达情况，以此来反映姜黄素对NF-κB p65活化情况的影响。结果如图3所示，PMA联合A23187能增加NF-κB p65在细胞核内的表达，激活HMC-1细胞中NF-κB活性;而在50 μmol/L姜黄素的作用下，却降低因 PMA加 A23187诱导的核内 NF-κB p65的表达，从而抑制NF-κB活性(P＜0.05)。

2.4 姜黄素对HMC-1细胞中caspase-1活性的影响 caspase-1活性实验结果如图4所示，PMA联合A23187能在HMC-1细胞中活化caspase-1，然而，在50 μmol/L姜黄素的作用下，却显著地抑制因PMA加A23187诱导的caspase-1活化(P＜0.05)。

图1 姜黄素对HMC-1细胞TSLP表达的影响Fig．1 Effects of curcumin on the production expression of TSLP in HMC-1 cells

图2 姜黄素对HMC-1细胞TSLP mRNA表达的影响Fig．2 Effects of curcumin on the expression of TSLP mRNA in HMC-1 cells

图3 姜黄素对HMC-1细胞NF-κB活化的影响Fig．3 Effects of curcumin on the activation of NF-κB in HMC-1 cells

3 讨论

姜黄素是一种天然化合物，是我国传统中药姜黄根茎中的天然有效成份，现已证明具有一定的抗炎、抗氧化、降血糖、抗肿瘤等活性。本研究主要探讨天然化合物姜黄素对胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)表达的影响。

图4 姜黄素在HMC-1细胞中对caspase-1活化的影响Fig．4 Effects of curcumin on the activation of caspase-1 in HMC-1 cells

PKC激活剂PMA一般是甘油二酯的替代物，而A23187则是一种广泛被使用的离子载体。相关研究表明，PMA联合A23187能刺激TSLP的产生[8]。此外，在特应性皮炎患者皮损处也存在TSLP的高表达[4]。在本研究中，通过ELISA和RT-PCR方法结果证实了姜黄素在蛋白及mRNA水平上均能显著地抑制由PMA与A23187诱导的TSLP表达。因此，我们推测姜黄素对TSLP升高引发的特应性皮炎等疾病有潜在的治疗作用。

NF-κB是一种调节参与免疫反应及炎症反应基因表达的转录因子。据报道，在各种细胞中如成纤维细胞、上皮细胞及肥大细胞中，人TSLP mRNA的表达均受控于 NF-κB[7，8]。Rafiee 等[9]研究发现姜黄素在酸化的HET-1A细胞中能抑制NF-κB的活化，此外，姜黄素还能在小鼠体内抑制NF-κB的结合能力[10]。同时，本研究发现姜黄素能抑制NF-κB p65在肥大细胞核内的表达，以此来反映姜黄素抑制 NF-κB 的活性。Kouzaki等[11]报道，蛋白酶能通过蛋白酶激活受体2(PAR-2)来诱导TSLP产生，因此，我们推测姜黄素抑制TSLP的表达，不仅是通过NF-κB途径，可能还与其他机制相关，如PAR-2。

Caspase-1能被多种前炎症刺激物所激活。本研究发现在前炎症刺激物(PMA及A23187)的刺激下，HMC-1细胞的caspase-1的活性显著增加。有相关研究报道，TSLP的表达和产生与caspase-1活性相关[7]。而本研究发现，在姜黄素的作用下可以抑制因前炎症刺激物诱导的caspase-1活性。因此，推测姜黄素抑制肥大细胞TSLP的表达和产生，可能是通过阻断caspase-1活性来实现的。

综上所述，本研究揭示了姜黄素能在肥大细胞中抑制由PMA联合A23187所诱导的炎症反应，其机制与阻断caspase-1及NF-κB的活性抑制TSLP的表达相关，提示着姜黄素在炎症治疗中有着潜在的应用前景。

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