正常成年男性精浆同型半胱氨酸浓度及其与精液参数关联性研究

赵铭佳，周善杰，袁冬，邱实，杨镒魟，杨向祎，周芳，卢文红，梁晓薇，谷翊群＊

（1.北京协和医学院研究生院，北京 100730；2.国家卫生计生委男性生殖健康重点实验室，国家人口计生委科学技术研究所，北京 100081）

血清同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是体内甲硫氨酸循环的正常代谢产物，是许多需甲基化反应和能量代谢的重要中间产物。许多学者做了大量关于血清Hcy与心脑血管疾病关联性研究，认为血清Hcy增高是动脉硬化的危险因子［1］。高血清Hcy还与某些内分泌疾病、肿瘤疾病、自身免疫性疾病以及神经退行性疾病有关系［2］。近些年越来越多的证据表明，Hcy代谢途径在生育力方面占有非常重要的地位［3，4］。本研究旨在探讨建立精浆Hcy的正常值参考范围，血清、精浆Hcy，精浆Hcy总含量与精液参数的关联性以及精浆Hcy浓度与血清Hcy浓度关联性的研究。

材料和方法

一、材料

1.精浆和血清样本：从北京人类精子库捐精者中招募了31例健康志愿者，排除心、肝、肾等重要脏器疾病，近3个月无用药史，年龄22～35周岁。精液常规分析按照《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第五版［5］进行分析。本项研究经伦理委员会批准，所有提供精子样本的志愿者签署书面知情同意书。

2.主要试剂及仪器：采用北京百奥莱博科技有限公司的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒，其试验批内误差小于9%，批间误差小于15%；BioTek ELx800酶标仪（伯腾，美国）、BioTek ELx50洗板机（伯腾，美国）、Megafuge 1.0R 离心机（贺利，德国）、Thermo Fresco 21离心机（贺利，德国）等。

二、实验方法

1.精浆制备：按《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第五版要求，所有志愿者均禁欲3～7d，手淫法留取精液于清洁无菌杯中。37℃水浴箱内孵育30min，精液液化后做常规分析，主要包括精液量、精子浓度、精子活力等指标。检测后将精液置于Thermo Fresco 21离心机，以4℃ 1，000g离心10min。仔细收集精浆，分装标记后存放于－70℃冰箱待统一测定。

2.血清制备：按试剂盒说明书留取标本，标本不可有溶血、乳浊、严重黄疸。采集空腹志愿者静脉血于自凝管，血液在室温自然凝固10～20min后，置于 Megafuge 1.0R 离心机，以2，500r／min离心20min。仔细收集上清，分装标记后存放于－70℃冰箱待统一测定。

3.精浆及血清Hey浓度的测定：将试剂盒和标本平衡至室温。参照使用说明书，首先将标准品次递稀释后加样，设空白孔，然后向待测样品孔逐一加入待测样品并稀释，然后经过温育、配液、洗涤、加酶、再温育、再洗涤、显色、终止等步骤，最后用酶标仪，以450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。应用 Curve Expert 1.3软件，以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。然后根据样品的OD值计算得出相应的浓度，再乘以稀释倍数后，最终得出样品的实际浓度。

三、统计学分析

将所得数据采用SPSS 12.0软件进行分析处理。先检验精浆Hcy浓度、血清Hcy浓度及精液参数是否为正态分布。如果为正态分布则探讨精浆Hcy的浓度范围采用正态分布法；如果为非正态分布则探讨精浆Hcy的浓度范围选用百分位数法。采用Spearman相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、精浆Hcy浓度的参考值范围

经正态性检验，精浆和血清Hcy浓度为偏态分布。采用SPSS 12.0分析得出精浆Hcy几何平均值为11.02μmol／L，中位数10.59μmol／L，按百分位数法分析健康青年男性精浆Hcy浓度的参考值范围为6.02～21.96μmol／L（95%CI）；血清 Hcy浓度几何平均值为21.21μmol／L，中位数10.74μmol／L，参考范围为7.3～236.45μmol／L（95%CI）（表1）。

表1 精浆及血清Hcy浓度的百分位点

二、精浆Hcy浓度、一次射精精浆Hcy总含量、血清Hcy浓度与精液参数之间的相关性分析

经正态性检验，血清Hcy浓度及精子活力为偏态分布，精子浓度、精液量及一次射精精浆中Hcy的总量近似正态分布。采用Spearman相关性分析结果如下（表2）。

表2 精浆Hcy浓度、一次射精精浆Hcy总含量及血清Hcy浓度与精液参数相关性

发现精浆Hcy浓度与精子活力存在显著负相关（图1），一次射精精浆Hcy总含量与精液量存在显著正相关；其余各指标之间无显著相关性。

图1 精浆Hcy浓度与精子活力相关性的散点图

三、血清Hcy浓度和精浆Hcy浓度的相关分析

由于血清Hcy浓度和精浆Hcy浓度均为偏态，所以采用Spearman相关分析，两者之间的相关性结果（r＝0.101，P＝0.589）显示不存在显著相关性。

讨 论

Hcy是体内三种含硫氨基酸之一，是甲硫氨酸循环和半胱氨酸代谢的重要中间产物，其本身并不参加蛋白质的合成。Hcy在体内主要代谢途径有三条：（1）Hcy在蛋氨酸合成酶（MS）及辅酶维生素B12参与下，与5－甲基四氢叶酸合成蛋氨酸和四氢叶酸，而5－甲基四氢叶酸是在亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）催化下还原而来；（2）Hcy在胱硫醚－β－合成酶（CBS）及辅酶维生素B6参与下，与丝氨酸缩合成胱硫醚，胱硫醚进一步断裂成胱氨酸和α－酮丁酸；（3）Hcy在细胞内形成后直接释放到细胞外液。如果某些环节发生问题就可能引起Hcy的堆积，会导致高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinaemia），进而对机体产生一系列有害影响。

近些年国外一些研究发现，生育力低下的男性精浆中Hcy的浓度明显高于正常男性，同时证实精液中Hcy水平升高可以损害胚胎的质量并引起出生缺陷［6，7］。但是目前国内关于Hcy与男性生育力方面的研究报道还甚少。本研究采用ELISA方法建立了健康青年男性精浆Hcy浓度参考值范围6.02～21.96μmol／L（95%CI），中位数10.59μmol／L，为进一步的深入研究提供了参考。但是，国外学者Boxmeer等［8］在研究中采用高效液相色谱法（HPLC）得出70例生育力正常男性精浆Hcy浓度中位数为4.7μmol／L（1.7～30.4μmol／L）。我们的检测结果与国外数据比较存在明显的差异。探求其原因可能与下列因素有关：（1）测定方法的不同及样本量的差别可能为出现差异的原因之一；（2）两者研究对象的种族、饮食结构、生活方式、生活环境等也是重要的影响因素；（3）由于精浆中蛋白含量很高，粘度大，因此给测量过程中产生困难，产生误差的概率增加。

本研究发现精浆Hcy浓度与精子活力存在显著负相关，提示精子活力下降伴随着精浆Hcy浓度的升高。因此推测，精浆Hcy浓度有可能成为反映精子活力的重要指标。精浆Hcy浓度增高可能会对精子产生某种毒害作用，使精子活力降低。除此之外，本研究未发现精浆Hcy浓度与其他精液参数存在显著相关性。Crha等［9］研究发现无精子症患者精浆Hcy水平显著低于正常人水平，由此可见，精浆中过高或过低的Hcy浓度都可能引起男性生育力降低。有证据表明，高浓度的Hcy有直接的细胞毒性，内膜的损伤，氧化应激物质（ROS）的过度产生，转甲基作用受到抑制，基因的异常表达［10］。但一些研究证明，少量的氧自由基对精子功能和精卵结合是必要的［11－13］。

本研究显示，精浆Hcy浓度与血清Hcy浓度无相关性（r＝0.101，P＝0.589），而且血清 Hcy与精子活力未呈现负相关，由此推测可能是精浆中的Hcy直接与精子接触发挥毒害作用。但是，Crha等［9］研究却发现，正常人血清Hcy浓度与精浆Hcy浓度之间存在显著正相关（r＝0.297，P＝0.019）。Boxmeer等［8，14］在两次研究中，关于精浆与血清Hcy浓度相关性却得出了相反的结论（r＝0.12，P＝0.41）和（r＝0.16，P＜0.05）。因此，要认清两者之间的相关性还有待进一步深入研究。在下一步的研究中应增加样本的数量，减小误差，同时更加注重血液中Hcy与精浆中Hcy相互转移机制的研究。本研究还显示，血清Hcy浓度与精液参数无显著相关性（P＞0.05），与Boxmeer等［14］研究结果一致。

目前，越来越多的证据表明Hcy对精子有影响。在生精细胞的增殖和分化发育过程中可以在不同的水平被干扰，从而影响到精子发生过程［15］。精子在成熟过程中细胞质会逐渐减少，细胞质内的抗氧化酶体系含量有限并逐渐减少，这会使成熟过程中的精子对氧化自由基的损伤非常脆弱［16］。精液作为精子的微环境，精浆中包括很多营养物质、酶和激素来保证精子正常代谢和精子功能，浓度过低或过高都会对精子功能产生影响。Hcy、叶酸和一碳单位代谢过程互相联系，叶酸缺乏和Hcy的堆积会导致高同型半胱氨酸血症。精浆Hcy增高引起炎症因子增多，这些炎症因子会引起精子参数下降和男性生育力降低。此外，精浆Hcy会使机体可利用的一氧化氮（NO）减低，NO代谢途径会影响到阴茎勃起、血睾屏障功能、精子运动能力、精子获能、顶体反应和受精［17，18］。总之，高浓度的精浆Hcy可以在精子发生及成熟后的不同阶段产生有害影响，进而影响生育力。

体内约90%的精浆来源于睾丸以外的附属腺体组织，而且很可能与输精管中的液体成分不同，且与在附睾中精子成熟的微环境亦不同。并且精浆的微环境与精子发生的微环境有着比较大的差别，所以检测睾丸穿刺组织中的Hcy浓度对研究Hcy对精子发生及成熟的影响会更有意义。此外，精子内Hcy浓度与精浆Hcy浓度、一次射精精浆Hcy的总含量、精液参数之间的关系也有待进一步研究。这将会更加全面的揭示精浆Hcy浓度变化对男性生育力的影响。

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