HPLC-ELSD测定人参归脾丸中黄芪甲苷的含量

2014-11-25李晓达郭伟英

锦州医科大学学报 2014年5期

李晓达，郭伟英

(辽宁医学院药学院，辽宁锦州 121001)

人参归脾丸是由人参80 g、白术(麸炒)160 g、茯苓160 g、甘草(蜜炙)40 g、黄芪(蜜炙)80 g、当归160 g、木香40 g、远志(去甘草炙)160 g、龙眼肉160 g、酸枣仁(炒)80 g 10 味中药组成［1］，用于益气补血，健脾养心用于心脾两虚，气血不足所致的心悸，怔忡，失眠健忘，食少体倦，面色萎黄以及脾不统血所致的便血崩漏带下诸症。炙黄芪协助人参有益气补脾的功效。黄芪甲苷是黄芪中的重要成分，通过测定黄芪甲苷的含量来达到对人参归脾丸的质量控制。因此本文测定了人参归脾丸中黄芪甲苷的含量。为人参归脾丸的质量控制提供更全面有效的方法。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪(日本日立公司)，L-2130四元梯度泵，D-2000 Elite 色谱工作站，蒸发光散射检测器(ELSD)(美国奥泰公司)。乙腈、甲醇和甲酸均为色谱纯，重蒸水为自制。黄芪甲苷对照品 (上海源叶生物科技有限公司，批号:20120501，纯度＞98.0%)。3 批市售人参归脾丸(购自锦州药店，规格9 g 丸批号:0010267，2013188，3010441);10 味单味药材(购自锦州药店)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱色谱柱Agilent TC C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱温25 ℃，流动相:甲醇-水 (75∶25)，流速1.0 mL·min-1;ELSD 参数:漂移管温度90 ℃，载气流量1.6 L·min-1，载气为空气;分离度均＞1.5;理论板数按黄芪甲苷计算不低于3 000;进样量10 μL。在上述色谱条件下各成分色谱峰峰型对称，黄芪甲苷与其他峰能够基线分离。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的黄芪甲苷对照品0.32 mg，置于1 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，备用。

2.2.2 样品溶液的制备取本品18 g，加入甲醇100 mL 超声提取2 次，每次30 min，合并提取液，减压浓缩至干，加水10 mL 超声溶解，用水饱和的正丁醇萃取3 次，合并正丁醇层，减压浓缩至干，加10 mL 甲醇溶解，过0.45 μm 滤膜，备用。

2.2.3 阴性样品制备按处方比例及工艺，制备不含黄芪的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备成阴性样品溶液，备用。

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线的制备分别精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇配制成浓度分别为600、450、300、150、75、37.5 μg·mL-1的系列溶液，按上述色谱条件分别进样测定。以溶液浓度的自然对数(X)为横坐标，峰面积积分值的自然对数(Y)为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y=0.942 1X +6.263 4 (r=0.999 8)。结果表明黄芪甲苷的含量在37.5～600 μg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.3.2 精密度考察精密吸取同一对照品溶液，按上述色谱条件重复进样6 次，每次10 μL，测定黄芪甲苷峰面积积分值。结果显示保留时间稳定，峰面积的RSD=0.76% (n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性考察取同一批号人参归脾丸6 份，在上述色谱条件下测定，计算黄芪甲苷含量的RSD 为0.61%，结果表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性考察精密吸取同一对照品溶液，室温下放置，于0，2，4，6，8，12 h 按上述色谱条件进样分析。测得黄芪甲苷峰面积的RSD 为1.1%。结果表明黄芪甲苷在12 h 内稳定。

2.3.5 加样回收率精密称取已知含量的人参归脾丸1 g，分别定量加入黄芪甲苷对照品，按上述色谱条件测定，计算加样回收率。结果:见表1，平均回收率为98.8%，RSD=3.4%。

2.4 样品含量测定取不同批号的样品，按上述色谱条件测定。结果见表2。样品和标准品的高效液相色谱图见图1。

表1 人参归脾丸回收率实验

表2 人参归脾丸中黄芪甲苷测定结果

3 讨论

人参归脾丸是较为常用的中成药，在部颁标准中只有显微鉴别和当归的薄层鉴别。缪金财［2］利用薄层色谱法对人参归脾丸中的人参和白术进行了定性鉴别。林德平［3］等对人参归脾丸中的黄芪、甘草、酸枣仁、木香分别薄层定性分析。尚春英［4］等通过薄层色谱法对人参归脾丸中的白术、甘草进行了鉴别。在对人参归脾丸的研究中缺乏对指标成分的定量分析，这对药品的质量控制带来了很大的不便。

对于检测器的选择，黄芪甲苷为黄芪中的主要成分，但黄芪甲苷在紫外检测器上只有末端有吸收，噪音大，灵敏度降低，因此对于黄芪甲苷的含量测定多采用蒸发光散射检测器［5-7］。蒸发光散射检测器为通用型质量检测器，检测时流动相在检测器内挥发成气体，样品组分形成气溶胶，进入检测室产生响应，响应大小由被分析物质的颗粒的数量和大小决定，从而获得理想的基线和检测的灵敏度，克服了紫外末端检测的不足［8］。

由于所研究的中成药中有10 味中药，成分复杂，在流动相选择和提取工艺方面都进行了详细的考察。对于流动相的选择，选取乙腈、水和甲醇水比例分别为(10∶90、20∶80、32∶68、50∶50、75∶25)结果以75∶25 分离效果好，黄芪甲苷能与其他成分达到基线分离，由于乙腈价格较贵和毒性较大，确定甲醇水为流动相。对于提取方法的选择，我们考察了甲醇提取直接检测和用正丁醇萃取后再检测，前者无法检测到黄芪甲苷，后者黄芪甲苷与其他成分分离效果较好。

本实验研究的方法能够快速，方便，准确的检测人参归脾丸中黄芪甲苷的含量，为人参归脾丸的质量控制提供参考。