烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）SRAP-PCR 体系建立及优化

赵艳琴，吴元华，赵秀香，安梦楠，陈建光

1沈阳农业大学/植物保护学院,辽宁沈阳市东陵路120号 110866；

2 内蒙古民族大学/农学院,内蒙古通辽霍林河大街22号 028043

烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）SRAP-PCR 体系建立及优化

赵艳琴1，2，吴元华1，赵秀香1，安梦楠1，陈建光1

1沈阳农业大学/植物保护学院,辽宁沈阳市东陵路120号 110866；

2 内蒙古民族大学/农学院,内蒙古通辽霍林河大街22号 028043

采用烟草靶斑病菌YC-9, LJT-8和QYS-7为DNA模板,初步筛选SRAP引物组合；采用L16(45)正交试验设计,对烟草靶斑病菌的SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs, Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板浓度等5个因素进行优化试验。结果表明：共筛出13对扩增条带清晰且多态性好的引物组合；烟草靶斑病菌的最佳SRAP反应体系为Mg2+浓度2.0 mmol/L、dNTP浓度200 μmol/L、Taq DNA聚合酶0.8 U、引物浓度140 mmol/L、模板DNA 20 ng及1×PCR buffer,反应总体积为20 μL；各因素对SRAP-PCR扩增反应结果影响的差异较大,依次为Taq DNA聚合酶＞引物＞ Mg2+＞ dNTPs=模板DNA。

烟草靶斑病菌；正交试验设计；反应体系优化；引物筛选

SRAP (Sequence related amplified polymorphism)技术是2001年Li和Quiros在芸苔属植物上开发出的新型分子标记技术[1]。该技术无需任何序列信息即可直接 PCR 扩增,从DNA 水平上直接检测基因组DNA 的多态性[2],相比此前广为应用的RAPD(Random amplification polymorphism DNA)技术以及AFLP (Amplified fragment length poly-morphism)等技术,SRAP技术稳定性和重复性好,并且成本低,简单快速[3]。目前SRAP技术已成功在多种植物遗传图谱和多样性分析的研究中应用[4-5],以及在植物病原物的遗传多样性研究中应用[6-7]。

烟草靶斑病（Thanatephorus cucumeris(Frank)Donk）在许多国家都有发生[8-10],是一种危害严重的烟草叶部病害。我国烟草靶斑病主要发生在烟草旺长期和成熟期,潜育期短、流行性强,严重影响烟叶的品质和产量[11]。烟草靶斑病菌的无性态为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）,目前针对我国烟草靶斑病菌的研究报道较少[12-14]。为明确烟草靶斑病菌的遗传多样性及进化背景,本文建立了烟草靶斑病菌SRAPPCR反应体系,并对引物进行了筛选,以期早日明确烟草靶斑病菌的遗传本质,为该病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

烟草靶斑病菌株YC-9,LJT-8和QYS-7,分别分离自铁岭市营厂乡,李家台乡及丹东市青椅山烟草靶斑病菌组织,保存于沈阳农业大学烟草研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取与检测

首先将菌株移植于PDA平板上,在28 ℃培养箱内培养3 d后,取5 mm直径的菌饼至含有10 mL的PD培养液的培养皿（9 cm）中,于28 ℃下静置培养3 d,过滤出菌丝,用无菌水冲洗,无菌滤纸吸干水分后于40℃干燥4 h后装入1.5 mL的离心管中,-20℃保存备用。

DNA提取采用北京天根生物技术公司DNA提取试剂盒按照说明进行,并采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

1.2.2 SRAP引物筛选

SRAP引物采用Li等已发表的序列Me1～Me10/Em1～Em10[1],由上海生工生物有限公司合成。选取菌株YC-9、LJT-8和QYS-7,对100对SRAP引物进行多态性初筛。

1.2.3 SRAP-PCR扩增反应体系及程序

基础反应体积为20 μL：l0×PCR buffer (Mg2+)2 μL, Mg2+0.2 μL, 10 mmol/L dNTPs (10 mmol/L Each) 1.6 μL, 正 反 向 引 物 (10 μmol/L)各 0.5 μL, TaqDNApolymerase (2.5 U/μL) 0.32 μL,模板DNA1.0 μL,用ddH2O定容至20 μL。

反应程序参照Li等的方法略加修改[1], 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min, 35 ℃ 1 min, 72 ℃ l min, 4 个循环 ;94 ℃ 1 min, 56 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 39 个循环 ;72 ℃10 min, 4 ℃保存。

扩增结束后,取7.5 μL扩增产物,与1.5 μL 6×Loading Buffer（TaKaRa）混匀,点入含0.5 μg/mL Goldview 的1.5% 琼脂糖凝胶中,以 DNA Marker DL2000（Tiangen）作为分子量标准,在 5 V/cm 电场强度下电泳 1～2 h,紫外凝胶成像仪下照相。

1.2.4 SRAP 反应体系优化

选取质量较好的菌株DNA作为模板及多态性好的一组SRAP引物进行反应体系优化试验。首先按照表1进行单因素优化,以确定各因子的适宜浓度范围,在此基础上参照表2采用五因素四水平L16（45）进行正交优化。参考张丽等分析统计方法[15],对 Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物以及模板DNA浓度水平进行优化以获得稳定的反应体系。

表1 单因子试验设计表Tab.1 Single-factor experiment

表2 烟草靶斑病菌SRAP-PCR反应体系的L16(45)正交试验设计表Tab.2 An orthogonal design of L16(45) of SRAP-PCR reaction system for Rhizoctonia solani from tobacco target spot

表2（续）

2 结果与分析

2.1 SRAP引物筛选

选取YC-9、LJT-8和QYS-7菌株对100对SRAP引物进行筛选,图1结果表明：筛选获得13组条带清晰且多态性好的引物组合,分别是Me1/Em2、Me3/Em2、Me3/Em9、Me4/Em4、Me4/Em6、Me4/Em9、Me5/Em3、Me5/Em9、Me6/Em2、Me6/Em8 和Me7/Em10 Me8/Em7和 Me9/Em5。

图1 优化SRAP反应体系部分引物中的扩增结果Fig.1 Amplified results of partial primer in the optimization of SRAP reaction system

2.2 SRAP反应体系优化

选择烟草靶斑病菌YC-9 基因组DNA及SRAP引物组合Me7/Em10进行体系优化。

2.2.1 Mg2+浓度

图2试验结果表明：当Mg2+浓度为1.0 mmol/L时,仅有较少的扩增条带数和扩增量；当Mg2+为1.5～2.5 mmol/L时,能获得较清晰的谱带且谱带数量增多,其中以2.5 mmol/L 的Mg2+浓度最佳；当Mg2+为3.0～4.5 mmol/L时,随着Mg2+浓度的增加扩增条带数变化不明显,但扩增量逐渐减少；至Mg2+为5 mmol/L时未扩增出谱带。

图2 Mg2+浓度对PCR扩增的影响Fig.2 Effect of Mg2+ density on the amplification of PCR

2.2.2 dNTPs浓度优化

图3表明：当dNTPs 为100 mmol/L时,获得谱带少且模糊不清,随着浓度增加,条带数增加,且清晰度增强,至dNTP的浓度为200 mmol/L时获得达到最多,最清晰；而当浓度进一步升高时,扩增谱带明显变弱,并且稳定性降低。

图3 dNTPs浓度对PCR扩增的影响Fig.3 Effect of dNTPs density on the amplification of PCR

2.2.3 Taq DNA聚合酶用量优化

由图4可知,当Taq DNA聚合酶为0.4 U时,扩增条带数明显少,且模糊不清；当用量为0.6～1.6 U时,谱带数及亮度基本一致；当Taq DNA聚合酶1.8～2.0 U比1.6 U增加一条谱带,清晰度有所增加。由于反应体系中 TaqDNA聚合酶的浓度过大时非特异性扩增可能增多,浓度过低又可能导致合成新链的效率的下降,最终导致扩增产物的减少,TaqDNA聚合酶的最佳用量为1.2 U即可。

图4 Taq DNA聚合酶用量对PCR扩增的影响Fig.4 Effect of Taq DNA polymerase on the amplification of PCR

由图5结果表明：引物浓度的变化对反应体系的影响较大,当引物浓度为800和700 μmol/L时,扩增条带较少且较弱,当引物浓度降低至100 μmol/L时,获得条带数量随之增加且条带清晰,增加多为250 bp以下的条带,扩增效果最好；当引物浓度增加至为900 μmol/L条带数和亮度也较700 μmol/L时增加,增加的多为1000 bp左右的大片段,但较密集。经比较认为引物的最佳浓度为100 μmol/L。

2.2.4 模板DNA用量

试验结果表明（图6）,当模板的用量为10～60 ng时,均能扩增出清晰的带型,随着模板DNA用量的增加,扩增出谱带数量基本一致,而谱带的亮度逐渐增加。模板20 ng时,谱带的亮度适于各条谱带的区分,并且能节省模板DNA的用量,确定为最佳模板用量,即20 μL反应体系中的20 ng模板DNA。

图6 模板DNA用量对PCR扩增的影响Fig.6 Effect of use of template DNA on the amplification ofPCR

2.2.5 SRAP反应体系的正交优化

比较单因素筛选结果,选出正交试验各因子较好的4个水平,进行正交试验体系优化。结果如图7所示,在16个正交组合中,各因素组合不同,扩增结果明显不同。16个处理均能扩出谱带,其中组合8的扩增谱带数量最多,最清晰。因此确定其为最佳反应体系。即模板DNA 20 ng,Mg2+浓度2.0 mmol/L,dNTP浓度200 mmol/L,Taq酶0.8 U,引物浓度140 mmol/L,反应总体积为20 μL。

图7 正交设计扩增的结果Fig.7 Results of amplified orthogonal design

对16个正交组合试验图谱进行统计分析,K代表因子在某水平下获得总条带数,k代表所对应K值的平均值,R代表k的最大值与最小值之差,对比R值的大小以反映因子对扩增结果的影响,即R越大影响越显著[15]。由表3可知,Mg2+以2水平的2.0 mmol/L最好,dNTPs 以4水平的200 mmol/L最好,引物则以3水平的140 mmol/L最好,模板DNA用量以4水平的20 ng用量最好,Taq DNA 聚合酶以1水平的0.8 U最好。该数据刚好与通过图谱观察最佳组合8的结果一致。进一步对比R大小,反应体系中对扩增结果的影响强弱顺序为Taq DNA聚合酶＞引物 ＞ Mg2+＞ dNTPs= 模板 DNA。

表3 正交试验结果的统计分析Tab.3 Analytical results of orthogonal experiments

3 结论与讨论

在PCR反应体系中各个因素间都会发生相互作用,如dNTPs会与Mg2+发生拮抗作用,Mg2+浓度又会对Taq DNA聚合酶的活性产生直接影响,而Taq DNA聚合酶在引物与模板DNA结合后的延伸中起重要作用[16]。因此,反应体系中无论哪个因素发生改变都会导致扩增结果的变化。采用PCR技术扩增多态性位点及遗传多样性研究,易受到这些因素的影响,因此一个适宜的PCR反应体系对于遗传多样性研究来说是尤为重要的。目前,PCR体系优化的方法中以单因素法和正交试验设计应用最为广泛,其中单因素分析法直观快速,但是忽略各因素间的互相作用[17],而正交试验设计较好的避免了这一点,但是正交试验的各因素水平范围宽泛,缺乏确定各因素水平的标准。将单因素法与正交试验设计结合能够弥补这些缺点。

初步筛选出13对SRAP引物可用于烟草靶斑病菌基因组的多态性分析；并结合了单因素与正交试验设计对烟草靶斑病菌SRAP-PCR反应体系进化优化,建立了适合该病菌的反应体系：模板DNA 20 ng,Mg2+浓度2.0 mmol/L,dNTP浓度200 mmol/L,Taq酶0.8 U,引物浓度140 mmol/L,反应总体积为20 μL。反应体系中对扩增结果的影响强弱顺序为Taq DNA聚合酶＞引物＞ Mg2+＞ dNTPs=模板DNA。

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Establishment and optimization of SRAP-PCR reaction system forRhizoctonia solanifrom tobacco target spot

ZHAO Yanqin1,2, WU Yuanhua1, ZHAO Xiuxiang1, AN Mengnan1, CHEN Jianguang1
1 College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China;
2 College of Agriculture, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao, 028043 China

SRAP primer pairs were screened for polymorphism using DNA ofRhizoctonia solaniisolates YC-9, LJT-8 and QYS-7 as templates.An orthogonal design of L16(45)was used to optimize SRAP-PCR reaction system forR.solaniof tobacco with 5 factors, namely Mg2+, dNTPs, primers, Taq DNA polymerase and template DNA.Results showed that a total of 13 polymorphic SRAP primer pairs were screened out of 100 SRAP primer pairs, and a suitable SRAP-PCR reaction system forRhizoctonia solanifrom tobacco target spot was 2.0 mmol.L-1 Mg2+, 200 mmol.L-1 dNTPs, 0.8U Taq DNA polymerase, 140 mmol.L-1 primer pairs, 20 ng template DNA and 1×PCR buffer.In addition, each factor in SRAP-PCR reaction system had different effects on amplified patterns in descending order of Taq DNA polymerase＞ primer＞Mg2+＞ dNTPs=DNA.

Rhizoctonia solanifrom tobacco target spot; orthogonal experiment design; optimization of reaction system; primer screening

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.016

S432.41; Q78 文献标志码：A 文章编号：1004-5708（2014）03-0096-06

国家烟草专卖局科技攻关项目 [国烟办综 (2010)182号]；辽宁省烟草专卖局科技攻关项目[辽烟计（2010）86号]

赵艳琴(1978—),博士研究生,植物病原真菌学,Email：zhaoyanqin782828@qq.com

吴元华（1963—）,博士,教授,植物病理学及生物农药,Email：wuyh09@vip.sina.com

2013-04-23