利用母本来源的单倍体技术获得双抗TMV和PVY烟草株系

刘勇，陈学军，肖炳光，李永平

云南省烟草农业科学研究院,云南昆明圆通街33号 650021

利用母本来源的单倍体技术获得双抗TMV和PVY烟草株系

刘勇，陈学军，肖炳光，李永平

云南省烟草农业科学研究院,云南昆明圆通街33号 650021

为选育双抗烟草花叶病毒（TMV）和马铃薯Y病毒（PVY）的烟草材料,采用Coker176与NC55杂交后代F1与非洲烟杂交获得单倍体苗,经过苗期抗性鉴定、分子标记辅助选择和叶脉培养加倍,获得母本来源的双抗TMV和PVY的双单倍体。通过人工接种抗性鉴定、标记检测和田间株系比较,获得抗性、植物学性状稳定的双单倍体第三代种子。与常规杂交系统选育相比较,双单倍体方法的获得后代变异更大、性状更容易稳定。

非洲烟；单倍体；TMV；PVY；育种

烟草常规杂交育种由于性状分离,需要经过4～5代的连续选择,才能获得性状稳定的品系。理论上,加倍单倍体的纯合只需要1个世代, 就能获得性状稳定株系。因此,采用单倍体育种技术,可明显缩短育种年限[1]。烟草单倍体诱导有来源于雄配子和雌配子2条途径,诱导来源于雄配子的单倍体的常用方法为花药培养,具有步骤简便,单倍体苗易获得等优点[2]。采用花粉离体培养或者游离小孢子培养获得雄核发育的单倍体也有报道[2]。但利用雄配子来源的单倍体育成的烟草品种存在产量降低等劣势,美国等烟草育种先进国家,并不采用雄配子来源的单倍体用于育种[3]。我国只有单育一号等几个烟草品种曾在生产上推广利用[4]。来源于雌配子的烟草单倍体育成的品种,无产量降低的劣势[5]。采用未授粉子房、胚株离体培养可诱导来源于雌配子的单倍体植株[6],但步骤复杂,难以满足育种的需求。利用远源杂交产生母本来源的单倍体,在玉米育种中应用广泛[7]。利用烟草野生种非洲烟（Nicotiana african）和烤烟杂交,产生母本来源的单倍体在美国育种应用广泛[8-9]。美国著名的烤烟品种NC71等,在选育过程中采用了母本来源的双单倍体技术。烟草单倍体加倍常用秋水仙碱处理生长点,存在加倍效率较低的问题[10]。叶脉组织培养加倍烟草单倍体,在美国应用较早。肯塔基大学的M.J.Kasperbauer等（1972）研究发现,利用叶片中脉组织培养方法[11],可以获得加倍单倍体植株,随着筛选方法的提高,目前国外同行的单倍体叶脉培养加倍率已达到80%左右。

烟草马铃薯 Y病毒病（PVY)和烟草花叶病（TMV）是危害烟草的重要病毒病害,通常混合发生[12]。烟草种质资源中,已鉴定出携带抗PVY基因va的烟草种质NC55[13]和携带抗TMV基因N的烟草种质Coker176[14]。但缺乏双抗PVY和TMV的烟草抗源。本文采用组合F1与非洲烟杂交产生母本来源的单倍体,苗期接种筛选抗病株,利用叶脉组织培养加倍等技术,获得双抗TMV和PVY的烟草育种中间材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

烟 草 种 质 Coker176（ 抗 TMV）、 NC55（ 抗PVY）和非洲烟（N.african）由本院提供。TMV和PVY毒源分别在防虫网室内繁殖保存。

1.2 杂交组合配制

利用常规方法配制Coker176和NC55的F1杂交组合。F1在塑料大棚内移栽,开花时,人工去雄,取非洲烟的花粉授粉。授粉后套袋,单株收种得到种子（F1-Naf）。去雄、授粉和收种要仔细操作,防止污染。

1.3 单倍体苗挑选与抗性鉴定

在塑料盘或育苗盘上密集播种F1-Naf。烟苗2片真叶时,用牙签标记类似单倍体的单株。烟苗4-5片真叶时,再次挑选类似单倍体的烟苗盆栽,成活后,混合接种TMV病叶汁液1000倍和PVY病叶汁液100倍。定期调查病害症状。筛选抗病的苗,淘汰感病苗。同时采用N基因[15]和Va基因的分子标记[16],检测验证类似单倍体苗的抗性。

1.4 叶脉组织培养加倍

开花时根据花的形态和是否结实,在抗病单株中挑选单倍体植株的中部叶片,取中脉组织培养。方法为：取主脉约铅笔粗细的中部叶片,剪取叶基部约5 cm长主脉,用自来水冲洗干净。用75﹪乙醇消毒1 min,无菌水冲洗2次,再用0.1﹪升汞消毒10 min,无菌水冲洗5～6次,将主脉切成小段。接种到MS+2.0 mg/L KT +0.2 mg/L NAA的培养基上诱芽,待芽长到2 cm高时,接种到1/2 MS培养基+IBA 0.5 mg/L中诱根培养,烟苗3 cm高时,假植至漂浮盘中,成活后盆栽或移栽大田。开花后选取可育单株套袋留种。对来源于同一个单倍体的加倍单株混合收种（DH1）。

1.5 加倍单株抗性鉴定与农艺性状观察

对双单倍体第1代材料(DH1),每份盆栽60株左右,苗期人工混合接种TMV和PVY,方法同上。调查发病情况,验证抗性是否稳定。对双单倍体第1代和第2代材料（DH2）进行株系比较试验,方法为大田双行区移栽60株,初步观察植物学性状和农艺性状,挑选表现较好的单株留种。

2 结果与分析

2.1 双抗TMV与PVY单倍体单株的获得与加倍

在Coker176（抗TMV）与NC55（抗PVY）的杂交的F1植株上,用非洲烟花粉授粉,2009年8月获得杂交种子（F1-Naf）。2009年9月播种,挑选出类似单倍体的烟苗约20株。苗期混合接种TMV/PVY,根据接种后第5 d至开花期的病害调查结果,筛选出3株双抗的单倍体和1株单抗TMV的单倍体（表1）。与PVY抗性相关的Va标记和与TMV抗性相关的N基因标记检测结果表明（表1）,3个双抗单株携带分别来源于双亲的va位点和N基因。通过叶脉组织培养加倍,2010年底获得双单倍体种子（双单倍体第1代株系（DH1））。

表1 单倍体苗抗性鉴定与标记检测Tab.1 Haploid seedlings resistance identification and marker detection

2.2 双单倍体第1代株系抗性鉴定与性状观察

2011年防虫温室内,每个双单倍体株系盆栽60株的苗期抗性鉴定结果表明：接种后5 d,3个株系的单株全部表现TMV枯斑；接种后21 d调查,V8-N2和V9-N2的PVY发病率为0,V9-N1的PVY发病率为6.35%（表2）。表明3个双单倍体第1代株系的对TMV和PVY的抗性稳定。大田株系比较试验表明,双单倍体株系间的植物学性状和农艺性状出现较明显的分离（表3）。V8-N2株系的叶片数少,叶片窄；V9-N1和V9-N2株系现蕾期的株高、叶型出现明显的宽叶与窄叶分离,挑选株型较好的单株留种,获得双倍体第2代（DH2）种子。

表2 双单倍体第1代株系抗性鉴定Tab.2 Resistance identification of first generation double-haploid lines

表3 双单倍体第1代株系的植物学与农艺性状Tab.3 The botanical and agronomic traits of first generation double-haploid lines

2.3 双单倍体第2代株系比较

2012年大田株系比较试验表明,双单倍体第2代株系的植物学性状和农艺性状出现趋于稳定（表4）。其中V9N2-12和V9N2-13与对照品种NC55的亩产量相当,在这两个株系中挑选株型较好的单株留种,获得双倍体第3代（DH3）种子。

表4 双单倍体第2代株系的植物学与农艺性状Tab.4 The botanical and agronomic traits of second generation double-haploid lines

2.4 双单倍体抗病育种的特点

以聚合TMV抗性（Coker 176的N基因）和NC55的PVY抗性（va位点）为例,双单倍体方法和常规杂交方法的程序差异较大（表5）。采用冬季加代,从F1种子开始至获得双抗且抗性纯合的种子,两种方法均需要18个月左右时间。双单倍体方法的工作量主要为配制F1与非洲烟杂交的种子、单倍体苗获得和单倍体加倍,技术难点为单倍体苗获得和加倍。常规杂交方法的工作量主要为F2抗病单株筛选和F3测交。双单倍体株系的抗性和农艺性状相对稳定,获得性状稳定的品系预计可比常规杂交方法缩短1～2年。双单倍体株系之间的叶片数和叶片大小等性状的变异较大。

表5 双单倍体与常规育种的程序比较Tab.5 Comparison between double-haploid disease-resistance breeding methods and conventional disease-resistance breeding methods

3 结论与讨论

双单倍体方法在聚合两种或多种抗性方面,具有后代目标性状容易稳定的优点,但同时存在技术较为复杂,获得单倍体和单倍体加倍的难度较大的问题,可通过增加F1与非洲烟的杂交种子数量及采用流式细胞仪辅助筛选单倍体的方法加以解决。本文采用叶脉培养加倍方法,该方法具有加倍效率较高的优点,但从叶脉培养至获得种子,需要12个月左右的时间。通过采用苗期鉴定单倍体苗,秋水仙碱处理腋芽[17]等加倍方法,预计可缩短加倍时间7个月左右。

致谢：感谢杨华兵和杨彦明在温室管理和组织培养中的帮助。

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Tobacco lines resistant to TMV and PVY obtained by maternal-derived haploid breeding methods

LIU Yong,CHEN Xuejun,XIAO Bingguang,LI Yongping
Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Science, Kunming 650021, China

Doubled haploid (DH) technique can accelerate traits stabilization in hybridization offspring.In the breeding of variety resistant to Tobacco mosaic virus (TMV) and Potato virus Y (PVY), haploids were obtained from F1hybrids between Coker176 and NC55 crossing as female toNicotiana african.TMV and PVY resistant haploids were selected by seedling resistance identification and molecular marker test.DH plants were regenerated from leaf mid-vein culture method.Artificial inoculated resistance evaluation, markers detection, and field comparison were conducted.The third generation seed of DH lines which showed stable resistance and botanical characters were harvested.Compared to conventional hybrid breeding methods, DH breeding method showed greater variation between offspring lines and objective traits were relatively more stable.

Nicotiana african;haploid; breeding

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.014

S435.72 文献标志码：A 文章编号：1004-5708（2014）03-0084-05

中国烟草总公司云南省公司科技项目（2010YN01,2012YN02）;云南省社会发展科技计划（2010CD127）

刘勇（1970—）,博士,副研究员,主要从事烟草病害防治与抗病育种研究,Tel：0871-65106352,Email: yliu@yntsti.com

李永平（1967—）,硕士,研究员,主要从事烟草育种研究,Email: liyongping@yntsti.com

2013-06-03