四环素调控HSV－tk基因在HeLa细胞内表达及抗肿瘤作用

王 茜，杜珍武，马青山，张桂珍＊

（1.吉林大学中日联谊医院 肾病内科，吉林 长春130033；2.吉林大学第二医院 中心研究室，吉林 长春130041；

3.吉林大学第一临床学院 儿科，吉林 长春130031）

单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk）基因为肿瘤治疗常用的自杀基因之一，其可将细胞内无毒的前体药物无氧鸟苷（GCV）转变成有毒性的药物，进而杀伤肿瘤细胞[1，2]。研究表明此类自杀基因在体内的过量表达，可损伤机体组织器官，因此调控该基因在体内的表达水平十分重要[3－5]。

四环素基因表达调控系统为较常用的基因表达调控系统[6，7]，本研究拟在构建四环素调控 HSV－tk基因表达系统的基础上[8，9]，探讨应用四环素调控HSV－tk基因在HeLa细胞内表达及其抗肿瘤作用，为HSV－tk基因可调控性治疗肿瘤研究奠定实验基础。

1 材料与方法1.1 主要材料

pcDNA6／TR 质粒载体 、pcDNA3.1（＋）质粒载体、pcDNA3.1－TetO2－TKI质粒载体（含四环素反应元件与HSV－tk基因）及HeLa细胞株由本院中心实验室提供；胎牛血清；DMEM培养基（高糖）；Trizol试剂；RT－PCR试剂盒；GCV、MTT、G418、强力霉素、杀稻瘟素；Attractene transfection reagent转染试剂盒；

1.2 方法

HeLa细胞培养、基因转染和基因表达检测、强力霉素调控HSV－tk基因杀伤HeLa细胞，操作按参考文献[8，9]进行。

2 结果

2.1 RT－PCR检测TR基因在HeLa细胞内表达结果

RT－PCR检测结果表明，未转染pcDNA6／TR质粒及转染质粒pcDNA3.1的HeLa细胞未检测到TR基因表达，而稳定转染pcDNA6／TR质粒的HeLa－TR细胞检测到TR基因的表达（见图1）。

2.2 RT－PCR检测强力霉素调控 HSV－tk基因在HeLa细胞内表达结果

稳定转染 TR 和 HSV－tk的 HeLa－TR－TetO2－TKI细胞，经过不同浓度的强力霉素作用48h后，其HSV－tk基因表达的RT－PCR结果显示：随着强力霉素浓度的增大，基因表达的量增加。强力霉素浓度4μg／ml时与 HeLa－TetO2－TKI细胞内 HSV－tk表达水平相当，说明此浓度强力霉素调控基因的表达水平达到了高峰（见图2）。

2.3 Dox调控 HeLa－TR－TetO2－TKI细胞对 GCV的敏感性

将 Dox（4μg／ml）分别加入 HeLa－TR－TetO2－TKI细胞及 HeLa－TetO2－TKI细胞，48h后给予不同浓度的GCV，72h后用 MTT法测定细胞存活率，判定GCV对各组细胞杀伤的敏感性。结果显示：未加Dox时，HeLa－TR－TetO2－TKI细胞对各浓度GCV的细胞杀伤不敏感，而加入Dox后，该细胞对各浓度GCV的细胞杀伤敏感，其50%生存率时GCV浓度为10μg／ml；无论Dox是否存在，HeLa－TetO2－TKI细胞对GCV的细胞杀伤均敏感，其50%生存率时GCV浓度为5μg／ml左右，见图3。

3 讨论

图1 RT－PCR检测TR基因在HeLa细胞内表达

图2 强力霉素调控 HeLa－TR－TetO2－TKI细胞内HSV－tk基因表达的RT－PCR电泳图

图3 Dox调控 HeLa－TR－TetO2－TKI细胞对GCV的敏感性

四环素调控的基因表达系统是利用大肠杆菌Tn10特异的四环素抗性操纵子原理建立的基因表达调控系统，属于负调控作用方式[10，11]，由两部分组成：调控部分，表达四环素调控的阻遏蛋白；操纵部分，由四环素反应元件及目的基因组成。基本调控过程如下：调控部分表达的阻遏蛋白TetR和操纵部分的四环素反应元件结合后，抑制了目的基因表达；而加入四环素后，四环素与TetR结合，导致TetR与四环素反应元件脱离，目的基因得以表达。本研究根据上述四环素调控基因表达的原理，应用双载体系统以及四环素类似物强力霉素调控HSV－tk基因在HeLa细胞内表达。实验结果表明：稳定转染四环素阻遏蛋白基因以及四环素反应元件及HSV－tk基因的HeLa细胞，未给予四环素类似物时，用RT－PCR方法检测 HSV－tk基因无表达；给予四环素类似物后，随着药物浓度的增大，HSV－tk基因表达升高。说明四环素可通过该双载体系统，有效地在体外调控HSV－tk基因在HeLa细胞内表达，同时调控了HSV－tk／GCV系统对HeLa细胞的杀伤作用。本研究应用四环素基因表达系统成功地调控了HSV－tk基因在HeLa细胞表达及其肿瘤杀伤功能，为探讨自杀基因杀伤肿瘤的可调控性提供理论基础。

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