不稳定型心绞痛患者白介素—10基因1082G/A多态性分析

史雷忠+钱志宏+李银福+倪悦+陈国琴

摘 要 目的：探讨中国常州地区人群白介素-10（IL-10）基因1082G/A多态性与不稳定型心绞痛（UAP）发病的关系。方法：招募了299例研究对象并分成UAP组（n=146）和对照组（n=153），经测序鉴定IL-10 基因1082G/A多态性，并检测血糖和血脂等生化指标。结果：IL-10 基因1082G/A在UAP组和对照组中均存在GG、AG和AA这3种基因型；3种基因型分布频率、等位基因分布频率与对照组相比均无统计学差异；调整对多个危险因素行多元logistic回归分析，示IL-10 基因1082G/A 3种基因型与UAP的发病仍无相关性。结论：IL-10 基因1082G/A 多态性与中国常州地区人群UAP的发病无相关性。

关键词 不稳定型心绞痛 白介素-10 基因多态性

中图分类号：R541.4 文献标识码：B 文章编号：1006-1533（2014）21-0046-04

Polymorphism analysis of interleukin-10 gene 1082G/A

in patients with unstable angina pectoris

SHI Leizhong，QIAN Zhihong， LI Yingfu， NI Yue， CHEN Guoqin

（Department of Cardiology， The Peoples Hospital of Liyang City， Liyang 213300， China）

ABSTRACT Objective： To study the association between the polymorphism of interleukin-10（IL-10）gene 1082G/A and the incidence of unstable angina pectoris （UAP） in the Chinese Han population of Changzhou region. Methods： Two hundred and ninety-nine subjects were recruited and divided into a UAP group （n=146） and a control group （n=153）， who were free from coronary artery disease. The polymorphism of IL-10 gene 1082G/A from those subjects was identified by sequencing and meanwhile biochemical indicators such as blood sugar and blood lipid were determined. Results： There were three kinds of genotypes including GG， AG and AA in two groups and the distribution frequencies of their genotypes and alleles had no statistical difference and the logistic regression analysis of multivariate risk factors such as smoking， blood pressure， blood sugar， TG， TC， LDL， HDL showed that genotypes and the incidence of UAP had no correlation either. Conclusion： The polymorphism of IL-10 gene was no associated with UAP in the Chinese Han population of Changzhou region.

KEY WORDS interleukin-10； gene polymorphism； unstable angina pectoris

炎症反应在不稳定型心绞痛（unstable angina pectoris，UAP）发病及发展过程中的作用得到越来越多的证实[1]，研究表明，白介素-10（IL-10）提高了动脉粥样斑块的稳定性，是粥样硬化的保护因子[2]。目前发现IL-10基因启动子具有多态性，IL-10合成的变化与基因变异有关[3]。UAP发病是遗传因素和基因缺陷共同作用的结果[4]。在两者共同作用下，各种炎性刺激因子形成炎症导致易损斑块的破裂是UAP发生的始动环节。1082G/A是IL-10基因的启动子，有报道表明，其与冠心病及脑梗死发病有关[5-6]。本研究以中国常州地区人群为研究对象，探讨IL-10基因——1082G/A单核苷酸多态性在UAP发病中的作用及临床意义。

资料与方法

研究对象

入选的299例研究对象分别来源于常州市溧阳人民医院和常州市武进医院，均为2010年6月-2013年3月在心内科住院的患者，其中确诊为UAP者146例作为UAP组，包含男106例，女44例，年龄 30～85岁，平均（65.57 ±10.55）岁，均符合ESC/ACC/AHA/WHF于2007年10月联合颁布的关于UAP的诊断标准，并经行冠状动脉造影证实存在冠状动脉病变。选择同期因胸闷、胸痛等原因住院行冠脉造影排除冠心病者153例作为对照组，包含男83例，女70例，年龄32～85岁，平均（60.98±10.43）岁。所有入选对象排除肝脏和肾脏疾病，恶性肿瘤，风湿类疾病，近期有急、慢性感染及炎症者。所有入选对象均签署知情同意书[7]。

研究方法

抽取研究对象外周静脉血2 ml，置入EDTA抗凝管，用 DNA试剂盒抽提基因组DNA，-70 ℃冰箱保存。引物由上海生物技术工程有限公司合成，上游引物为5'-TGGCTCCCCTTACCTTCTACA-3'，下游引物为5'-GGGTGGGCTAAATATCCTCAA-3'。PCR扩增溶液共50 ?l，溶液内包括： 1 ?l 4×dNTP约50 ng、5 ?l Taq buffer、5 ?l 25 mmol/L MgCl2、1 ?l 10 pmol上、下游引物、0.5 ?l EXTaq 酶2.5 U和1 ?l DNA模板约100 ng， 35.5 ?l去离子水。循环参数：95 ℃预变性3 min，然后按94 ℃ 30 s，58 ℃ 35 s，进行35个循环，终末延伸72 ℃ 5 min。反应结束后，取PCR产物5 ?l， 1%琼脂糖电泳，150 V、100 mA 20 min电泳观察。然后纯化PCR产物，并用回收试剂盒回收产物进一步测序鉴定IL-10基因启动子——1082G/A位点基因型。同时采用全自动生化分析仪（奥林巴斯公司）测定三酰甘油（ TG）、胆固醇（TC）、低密度脂蛋白 （LDL-c）、高密度脂蛋白（HDL-c）和血糖（Glu）等指标。

统计学分析

应用SPSS 14.0软件进行资料分析。组间计量资料以（）表示，用t检验；基因型和等位基因频率比较及Hardy-Werberg平衡程度用χ2检验，用多元logistic回归分析基因型与UAP发病的相关性，关联程度用0R 和95% CI表示，P<0.05为差异有显著性意义。

结果

UAP组与对照组的临床资料比较

UAP组年龄大，男性多，吸烟者及糖尿病患者明显多于对照组（P<0.01），两组间高血压、HDL-C等组成比较无差异，但发现UAP组TC、TG、LDL-c明显增高（表1）。

基因多态性分型

IL-10——1082G/A基因多态位点经PCR扩增后获得目的片段大小为140 bp，结果见图1，图2。

基因构成比比较

两组中均存在GG、AG和AA这3种基因型，比较两组间基因型频率和等位基因频率分布均无明显差异（P>0.05）；调整年龄、性别（男性为1，女性为0）、吸烟、高血压病、糖尿病、血脂对GG、AG 、AA这3种基因型行多个相关危险因素Logistic分析比较仍无相关性（P>0.05，表2）。

讨论

UAP是冠状动脉粥样硬化引起血管内膜损伤、斑块破溃脱落，继发血小板激活、聚集、黏附、血栓形成，导致冠状动脉的不完全闭塞，引起胸闷、胸痛，发病与炎症反应密切相关[8]。

IL-10是分子量为30～40 kD的酸性蛋白，其成熟形式含有160个氨基酸，活性形式通常是通过二键构成二聚体多肽，其基因定位于第l号染色体上由5个外显子及3个内含子组成，转录的mRNA长约2 Kb[9-10]，IL-10有广泛生物学作用，在机体中主要起着免疫抑制和抗炎症两大作用，已发现IL-10与自身免疫性疾病（如溃疡性结肠炎、Crohn病、风湿性关节炎等）的发病密切相关，且参与了心血管疾病的发病过程。

有研究表明，急性冠脉综合征的患者IL-10的水平降低，并与恶性心血管事件的发生呈正相关[11]。实验表明，急性冠脉综合征患者氧化LDL刺激的巨噬细胞中，IL-10能减少血管泡沫细胞凋亡，说明IL-10能对抗氧化LDL诱导的泡沫细胞的凋亡，进一步提示IL-10提高了斑块的稳定性，是粥样硬化的保护因子。

IL-10基因启动子具有多态性，IL-10合成的变化与基因变异有关。Turner等[3]发现IL-10基因启动子——1082 G向A的转变，在一定刺激下可使IL-10蛋白表达下调30%，Olivieri等[12]发现IL-10启动子区域的1082 GG基因型表达增多和IL-10水平的增加，可以抑制慢性血管损伤引起的炎症反应并减少动脉粥样硬化合并症的危险性。已有报道高加索人GA+AA基因型与冠心病发病相关[5]，表明IL-10 1082 GG基因型表达增多和IL-10水平的增加是血管性疾病的保护因子。

本研究共入选中国常州地区汉族人299例为研究对象，其中UAP组146 例，对照组153例，检测了IL-10基因启动子——1082G/A单核苷酸多态性，发现两组均存在GG、AG、AA这3种基因型，且基因型分布符合HaIdy-Weinberg平衡。与对照组相比，UAP组3种基因型和A、G等位基因频率分布无显著差异，经多因素logstic回归分析后发现，3种基因型与UAP的发病仍无相关性，结果提示，该基因变异不是中国常州地区汉族人群UAP发病的易感因素，且与国外研究相比，GG基因型明显偏少，与国外研究存有较大的差异。分析可能有以下原因：①心血管疾病是一种复杂的多基因遗传性疾病，种族差异所致遗传易感性在不同人群种族中具有差异，而且外部环境因素也参与该疾病的发生和发展。②样本存在不均一性，如性别、发病年龄等，本研究对象的平均年龄较大，两组间存在较大年龄差异。③试验设计不完全相同以及样本量偏小，缺乏大规模的前瞻性研究。

综上所述，不同种族人群中，IL-10基因——1082G/A多态性频率差异较大，IL-10基因——1082G/A变异在中国常州地区人群中发生频率与UAP的发病无显著性相关。IL-10基因多态性与UAP的确切联系及在心血管疾病中的预测价值尚需多中心、大样本量的研究及在功能学方面的进一步研究。

参考文献

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（收稿日期：2014-06-27）

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