WspR在大肠杆菌中的表达及其对c－di－GMP合成的影响＊

凡责艳， 木佳， 毛自朝， 官会林

（1.云南师范大学 能源与环境科学学院，云南 昆明650092；2.云南农业大学 农业与生物技术学院，云南 昆明650201）

可得胶（curdlan），又称热凝胶，是农杆菌ATCC31749菌株所产生的一种胞外多糖，由400～500个D－葡萄糖以β－（1→3）糖苷键线性连接而成的一类葡聚糖［1－2］；由于其具有凝胶强度高、热成型后不可逆、无色、无味和保水力强等特性，已被广泛应用于农业、建筑及化工行业等多个领域，在食品、化妆品等中用为添加剂；其抗HIV、抗肿瘤、提高免疫力活性等特性使其具有广阔的医用前景［3－4］.目前全球可得胶产品约有60亿美元的市场份额，并预计以每年10%左右的需求速度增长.相关研究发现，大多数细菌胞外多糖的合成受控于新近发现环二鸟苷酸（c－di－GMP），该c－di－GMP是细菌中参与各种生理功能调节的第二信使［5－7］，其合成及分解涉及三个蛋白质域，其中GGDEF结构域为c－di－GMP合成中的二鸟核苷酸环化酶，而 EAL 和 HD－GYP域是c－di－GMP分解中的磷酸二酯酶［5，8－9］.细菌中广泛分布有 这三个结构域［5－6，9］，具有GGDEF、EAL、及HDGYP结构域的蛋白质参与到细菌纤维素生物合成、移动性、附着性、生物膜形成、毒力因子生产和致病 性［7－8，10－12］.作为细菌中的第二信使，c－di－GMP除具有上述功能外，还能够刺激胞外多糖的生物合成［13］.大量研究表明，从绿脓杆菌（P.aeruginosa）中得到的类超化系统蛋白WspR具有GGDFE结构域，有DGC活性，可促进c－di－GMP的合成［14－17］.生物信息学分析发现，土壤农杆菌ATCC31749含有十几个GGDEF保守结构域［18］.因此，如能在 ATCC31749中提高 WspR的表达活性，就能提高c－di－GMP的产生，从而促进胞外多糖可得胶的合成.本实验将ATCC31749的WspR克隆到pQE81L，并转入大肠杆菌，以确定WspR的表达是否可促进c－di－GMP的合成，下一步探究WspR在ATCC31749中作用及其对可得胶的合成调控研究提供基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、质粒

土壤农杆菌 ATCC31749、WspR cDNA模板，大肠杆菌BL21（DE3），质粒载体pQE81L，均由云南农业大学生物化学与分子生物学实验室提供.

1.1.2 酶和试剂

限制性内切酶（SalI，BamHI）和 T4DNA连接酶购自Promega公司；Tap DNA聚合酶和dNTP购自TakaRa公司；血红素、吖啶黄、ABTS（2，2－联氮－二（3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸）二铵盐）、30%过氧化氢购买于sigma公司，其他试剂均为分析纯.

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

根据GenBank中报道的pQE81L－WspR基因序列，设计合成含有相关酶切位点的上下游引物，并由上海生工生物工程有限公司合成.

1.2.2 目的基因的PCR扩增

根据pQE81L－WspR基因序列设计引物，上游引物：5′－GCGGATAACAATTTCACAC－3′；下游引物：5′－GCAGCACCAGGTTAGTTTCC－3′.PCR反应体系为：WspR 的cDNA 模板2.5 μL，10×PCR buffer 5 μL（含 Mg2＋），2.5 mmol／L的dNTP 4μL，50μmol／L的上下游引物各1μL，5U／μL的Tap DNA聚合酶0.5μL，加去离子水至总体积为50μL.PCR反应程序：94℃ 预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸5 min.结束反应，PCR产物放置于4℃冰箱，留待电泳检测.PCR产物的检测：配制1%（w／v）的琼脂糖凝胶，取5μL的PCR产物pQE81L－WspR同1μL的6×Loading buffer（1mL 6×Loading buffer混有25μL的花青素）混匀上样，所用Marker为250bp－I DNA ladder.上样后，凝胶于1×TAE缓冲液中，120V，电泳45min.电泳结束后使用IQuant capture凝胶成像分析系统拍照分析.

1.2.3 WspR蛋白表达的初步检测

1.2.3.1 WspR蛋白的诱导表达

将冻存的含有pQE81L－WspR的重组质粒转入BL21菌株中，在LB含卡那霉素抗性固体平板上划线活化，37℃温箱倒置培养12～16h.挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃恒温摇床中200rpm振荡过夜培养.次日，按1∶100的比例，将种子液接种于LB液体培养基中，200 rpm，37 ℃振荡培养.待OD600达到0.5～1.0时，加入0.1mol／L的IPTG至终浓度为1mmol／L，之后低温30℃，200rpm振荡培养.并在培养0，2，4，6h后分别取样1mL，留作SDS－PAGE电泳检测.

1.2.3.2 WspR诱导表达后粗蛋白样品的处理

将诱导时所取的样品12 000rpm离心5min，弃去上清液.用无菌去离子水清洗细胞沉淀，同样12 000rpm离心，弃上清，并重复1次.按照0.2g／mL的比例加2×Loading Buffer（其中含5%的巯基乙醇），混匀.混匀后的样品于沸水中煮15min，之后液氮速冻，如此重复3次.解冻后，12 000rpm 离心3min.留待SDS－PAGE检测.

1.2.4 c－di－GMP的粗提取

将菌株BL21pQE81L－WspR、BL21 pQE81L分别用接种环蘸取一定量在已倒好的LB固体培养基上划板培养，37 ℃恒温摇床中180rpm培养12h，然后分别在两菌株平板上挑取一个单菌落接于5mL LB液体培养基中（培养菌株BL21pQE81L－WspR的培养基加入Amp抗生素，培养菌株BL21pQE81L的培养基加入Amp和Kan抗生素），37℃恒温摇床中180rpm振荡培养过夜；取1mL上述菌液接种于50mL LB培养基中，37℃恒温摇床中180rpm振荡培养4～6h，至 OD600值为0.4～0.6左右，停止培养；在超菌台上往培养基中加入0.1M的IPTG 250μL（最终浓度为0.5M）诱导，28℃摇床，180 rpm培养4h.

把上述诱导好的菌液分别用两个50mL的离心管平均分装成两管（每管25mL），高速离心机4℃，12 000rpm离心15分钟；倒掉上清液，沉淀用25mL的双蒸水洗涤一次，4 ℃，12 000 rpm离心10分钟后，再重复一次；倒掉上清液，用1mL 10mM Tris－HCl （pH 8.0，含100mM NaCl）溶液进行重悬；向悬浮液中加入25μL的25mg／mL的溶菌酶；将悬浮液用细胞破碎仪破碎细胞（2mm超声探头，50%功率）每次3s，间隙3s，30min，使外膜破裂，溶菌酶进入细胞壁；向溶液中加入60%的HClO4，至终浓度为20%，使悬浮液的大分子物质沉淀；将悬浮液放置于冰上10min，用约1.5mL 3MKOH（含0.4M Tris和2MKCl）溶液中和至PH＝7.0；再次用高速离心机12 000r／min，4℃离心10min；取上清液，用0.2μm滤膜的细菌过滤器进行过滤，即得到c－di－GMP粗提取品，将滤液用2mL的离心管保存在－80℃冰箱备用.

1.2.5 c－di－GMP的初步检测

本过程分成对照组和实验组：对照组加入菌株BL21pQE81Lc－di－GMP的粗提取物，实验组加菌 株 BL21pQE81L－WspR 的 c－di－GMP 粗提物.

取四个无菌2.5mL的离心管，其中两管里加入23ul的pQE81L，另外两管两管里加入23 μL的pQE81L－WspR，然后往四个离心管里各加入50mM Tris－HCl（pH 8.0，含100mM KCl）550μL，血红素32.6μL混匀，放入水浴锅中加热至95℃，并保持5min；冷却上述混合液至常温，保持15min，分别往四个离心管里加入2.6 μL的吖啶黄，放入4 ℃冰箱12h；从冰箱里取出，分别往里面加入109.8μL ABTS，并放入16℃冰箱15min；然后加入5μL的30%的过氧化氢混匀，观察各管内颜色变化，即可检测出c－di－GMP合成酶基因WspR在大肠杆菌中的表达情况.

2 结果与分析

2.1 质粒pQE81L－WspR的构建

将质粒载体pQE81L和目的基因片段WspR进行双酶切，然后用T4DNA连接酶将载体和目的基因片段连接，转化大肠杆菌BL21（DE3）得到重组质粒，如图1所示.

图1 pQE81L－WspR质粒构建流程Fig.1 The process of building plasmid pQE81L－WspR

2.2 PCR扩增检测携带pQE81L－WspR的阳性转化子

转入大肠杆菌中的质粒pQE81L－WspR，经菌落PCR扩增检测呈阳性的克隆提取质粒进行PCR鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测图谱中呈现588bp左右的目的基因条带，与预期结果一致，说明大肠杆菌BL21PQE81L已携带WspR的阳性转化子，如图2所示.

图2 pQE81L－WspR的鉴定Fig.2 The identification of pQE81L－WspR

2.3 蛋白表达结果

通过SDS－PAGE凝胶电泳，可以初步确定蛋白表达图谱上增加了一条40kD左右的条带，为WspR蛋白，如图3所示.

图3 pQE81L－WspR在E.coli BL21菌株中的表达Fig.3 The expression of pQE81L－WspR in E.coli

2.4 c－di－GMP存在性检测

根据 c－di－GMP的检测步骤，当加入血红素时，pQE81L系列为无色，pQE81L－WspR系列为浅浅的红绿色，如图4所示；再加入吖啶黄时，pQE81L系列为浅浅的黄色，pQE81L－WspR系列为深黄色，如图5所示；所有药品加完时pQE81L系列为浅绿色，pQE81L－WspR系列为深绿色，如图6所示.

上述实验经多次反复操作，颜色变化保持一致，表明大肠杆菌BL21pQE81L－WspR参与合成了 c－di－GMP，并且c－di－GMP氧化ABTS 为ABTS＋离子，是整个溶液表现出ABTS＋离子的颜色，即绿色.而大肠杆菌BL21pQE81L虽然也合成了c－di－GMP，使溶液表现淡淡的浅绿色，但相比WspR基因存在下合成的量却很少.

综上所述，WspR受体蛋白能促进大肠杆菌合成第二信使c－di－GMP，并且大大加速了c－di－GMP的合成量.

图4 加入血红素后的颜色变化Fig.4 The colour change after adding hemin

图5 加入吖啶黄后的颜色变化 Fig.5 The colour change after adding acriflavine

图6 加完ABTS和H2O2之后的颜色变化 Fig.6 The colour change after adding ABTS and H2O2

3 讨 论

作为一个广泛存在的第二信使－环二鸟苷酸（c－di－GMP），国内外在有关代谢调控、细胞功能和信号传导的作用等方面取得了重要的进展［19－23］.但是目前对土壤农杆菌 ATCC31749中c－di－GMP的调控机制目前还不清楚，而我们通过研究验证WspR能在大肠杆菌中表达，并促进cdi－GMP大量表达，这为下一步研究 WspR在土壤农杆菌ATCC31749中促进c－di－GMP合成提供基础，进而为可得胶合成提供一定的依据.

虽然我们初步证实了WspR受体蛋白能在大肠杆菌中促进c－di－GMP大量表达，但相关研究还有许多问题尚待解决：①合成c－di－GMP的影响因素、最佳条件、调控机制；②WspR能否在土壤农杆菌ATCC31749中合成c－di－GMP并表达大量的胞外多糖可得胶；③寻找菌体内c－di－GMP作用的靶点，但是还有许多细菌并不含有GEMM RNA，那么这些细菌中c－di－GMP第二信使传导通路是否存在其他调节机制有待于进一步研究.未来的研究中，鉴定新的c－di－GMP调控是我们迫切需要解决的问题.

4 结 论

绿脓杆菌中得到的类趋化系统蛋白 WspR在大肠杆菌BL21中顺利促进合成c－di－GMP，并且合成量能大大增加.而大肠杆菌是大量高效表达纯化蛋白质的模式菌株，这就为后期研究WspR受体蛋白在土壤农杆菌ATCC31749中促进合成c－di－GMP，进而合成胞外多糖可得胶提供了确切可行的依据.

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