红火蚁告警信息素的GC-EAD分析

刘先福，陈 立，李俊凯

1长江大学农学院，湖北 荆州434025;2中国科学院动物研究所，农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室，北京100101

信息素(pheronmone)在协调社会性昆虫个体之间的生理和行为活动及完成整个群体生存所必要的活动方面起着重要的作用，对于其完成认同与集群、识别、生殖、报警和防御等社会性通讯尤为重要。根据蚂蚁家族个体分工的不同，蚂蚁信息素大致可分为3 类，即蚁后信息素(queen-produced pheromone)、工蚁信息素(worker-derived pheromone)和幼虫信息素(brood-produced pheromone)(Rosen et al.，1996)。工蚁的主要功能是觅食、防御，所以工蚁释放的信息素主要有两大类:一种是由头部上颚腺分泌的告警信息素(alarm pheronmone)，能让蚁群免于外敌入侵而遭受侵害;另外一种是由腹部杜氏腺分泌的跟踪信息素(trail pheronmone)，具有高效的觅食和招募功能(Wilson，1962)。这2 类信息素保证了工蚁个体间的信息交流。

通常在反击过程中，告警信息素能够加强蚂蚁的移动速度和进攻强度(Brown et al.，1970)。然而，对于蚂蚁这种个体较小，且蚁巢内相互交流较少的种群，告警信息素更多的是起到一个及时疏散成员的作用(Regnier ＆ Wilson，1969)。关于蚂蚁告警信息素的化学成分研究已有大量报道(Bradsha et al.，1975;Hernandez et al.，1999;Wheeler et al.，1975)。第1 个告警信息素是从切叶蚁Atta texana Buckley 体内提取、分离得到，其主要成分是4-甲基-3-庚酮(Moser et al.，1968)。进一步研究发现，4-甲基-3-庚酮还能引起A.texana (Buckley)、A.robusta Borgmeier、A.bisphaerica Forel、A.capiguara Gon alves 和A.sexdens (L.)等5 种蚂蚁的告警行为(Blum，1968;Moser et al.，1968;Riley et al.，1974)。而据研究报道，红火蚁Solenopsis invicta Buren 的告警信息素的主要成分是2-乙基-3，6-二甲基吡嗪(Vandermeer et al.，2010)。

人工合成的2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪标准样品的比例为45%:55%的2-乙基-3，6-二甲基吡嗪和其同分异构体2-乙基-3，5-二甲基吡嗪的混合物(Sugimoto et al.，2006)。由于没有红火蚁告警信息素标准样品纯品，在利用告警信息素样品做生物试验时，必须考虑到混合物的作用。这一对异构体可在气相色谱柱上分开，所以用气相色谱—触角电位联用仪(GC-EAD)分析红火蚁工蚁对告警信息素混合物中2 种化合物的电生理反应时，就能验证红火蚁告警信息素混合物中的有效成分，为进一步研究告警信息素对红火蚁告警行为的调控提供参考。红火蚁告警信息素在红火蚁体内属于极微量化合物，本试验拟用柱层析法分离大量红火蚁浸提液，然后与标准样品对比GC-MS 离子图，以确定是否能得到红火蚁告警信息素流分。

1 材料与方法

1.1 供试材料及仪器

1.1.1 供试虫源 红火蚁种群采自红火蚁发生区广东省广州市及周边几个地区。从野外采回的红火蚁，在实验室利用“水试管”提供清水和10%的蜂蜜水，每天每巢投放3 ～5 头黄粉虫Tenebrio molitor L.(吕利华等，2006)。

1.1.2 主要试剂及仪器 正己烷，色谱纯，上海安谱科学仪器有限公司;丙酮，分析纯，国药集团化学试剂北京有限公司;2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;高纯氮气、氦气，北京千禧京城气体销售中心;聚四氟乙烯乳液，广州兴胜杰科技有限公司;硅胶柱，内径22 mm，北京欣维尔玻璃仪器有限公司;硅胶粉，300 ～400 目，青岛海洋化工厂。气相色谱仪GC7890A、气相色谱—质谱联用仪GC-MS，7890A-5975C，美国Agilent Technologies 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 红火蚁告警信息素分离分析 将200 g 红火蚁工蚁置于-20 ℃的冰箱中冷冻60 min，用470 mL色谱纯级正己烷浸提48 h，取出浸提液，加入30 g无水硫酸钠，处理12 h 后取出，置于4 ℃冰箱冷藏待用。告警信息素标品为2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪，浓度为1 μg·μL-1，溶剂为色谱纯级正己烷。

取上述工蚁浸提液，用硅胶柱层析法(80.0 g，300 ～400 目硅胶载入直径22 mm 层析柱)分离含有吡嗪的流分。用正己烷与丙酮按比例冲洗层析柱，每管收集2 mL 为1 个流分，然后用GC 测定每个流分 的化 学成 分(Chen ＆ Fadamiro，2009a、2009b)。柱层析分离所收集的流分样品用Agilent 7890A 气相色谱仪进行分析，色谱柱为HP-5MS 毛细管柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm film thickness，Agilent Technologies)，进样量1 μL，无分流进样。样品检测程序:进样口温度230 ℃，程序升温起始温度50 ℃，以5 ℃·min-1的速率升至100 ℃，以10 ℃·min-1的速率升至240 ℃，保持4 min，总共分析时间30 min。检测器为火焰离子检测器(FID)，温度260 ℃。将GC 色谱图相同或相近的流分合并成1 个流分。同时进一针标准样品，通过对比GC 保留时间来确定吡嗪流分，然后将吡嗪流分浓缩至1 mL，进行GC-MS 分析。用GC-MS 分析过柱收集到的吡嗪流分和告警信息素标品混合物，对比2 组数据的离子峰和保留时间，确定样品中吡嗪流分中的告警信息素成分。

1.2.2 红火蚁告警信息素混合物气相色谱—触角电位联用(GC-EAD)分析 EAG 试验所用缓冲液为Ringer's 生理盐水，各组分配比为氯化钠0.75 g，氯化钾0.035 g，氯化钙0.029 g，水100 g。将银丝插入2 个电极中，挑选1 对端口较小的玻璃毛细管，作记录和参比电极。

挑选1 头体型较大的工蚁，放置在玻片上，用手术刀快速切下头部，切口端与充满Ringer's 生理盐水的参比电极相连，触角的尖端连接记录电极。电极通过镀氯化银银丝与信号放大器连接，信号通过探针监测(PRG-3，Syntech®，the Netherlands)，用GC-EAD 软件(Syntech®，the Netherlands)记录和分析数据(Chen ＆ Fadamiro，2007)。

GC-EAD 分析色谱柱为HP-5MS 毛细管柱，进样量2 μL，无分流进样。色谱条件同1.2.1。测试的样品为2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪，即告警信息素混合物，浓度1 μg·μL-1。程序结束后保存FID离子检测图与EAD 图谱。

2 结果与分析

2.1 红火蚁告警信息素分离分析

红火蚁工蚁浸提液通过硅胶柱层析分离，用正己烷和丙酮溶剂体系能够分离得到告警信息素流分，经过GC-FID 分析浓缩得到1 mL 吡嗪流分。对样品中吡嗪流分和标准样品中告警信息素混合物进行GC-MS 分析，得到2 个样品的GC-MS 总离子色谱图(图1)，色谱峰1 的质谱图见图2。由图1可知，提取物样品中吡嗪流分的色谱图中在11.45 min 出现了一个峰，经质谱鉴定以及与标准样品对比保留时间，发现吡嗪流分中的峰1 和合成标准品混合物中峰1 是同一种化合物。通过比对文献中合成吡嗪混合物的色谱图出峰顺序和含量比，确定峰1 是2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，峰2 是2-乙基-3，5-二甲基吡嗪(Sugimoto et al.，2006)。此结果说明，大量红火蚁工蚁浸提液过柱能够得到告警信息素的成分，但含量非常低。

图1 红火蚁工蚁浸提物中吡嗪流分(A)和告警信息素标准样品混合物(B)的总离子色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of the pyrazinefraction of the body extract from workers of S.invicta (A)and synthetic alarm pheromone component mixture(B)

2.2 红火蚁告警信息素标准样品混合物GC-EAD分析

红火蚁工蚁对告警信息素混合物GC-EAD 反应如图3。合成告警信息素标准样品为2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪的混合物，经过GC-EAD 分析，发现红火蚁工蚁对2 种化合物均有电生理反应，其中活性高的为化合物1，活性低的为化合物2。与GCMS 离子图谱比对，发现化合物1 为2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，化合物2 为2-乙基-3，5-二甲基吡嗪。GC-EAD 结果证实红火蚁工蚁对2-乙基-3，6-二甲基吡嗪(即告警信息素)的电生理反应比对其同分异构体2-乙基-3，5-二甲基吡嗪的反应大。

图2 2-乙基-3，6-二甲基吡嗪的质谱图Fig.2 Mass spectra of 2-ethyl-3，6-dimethylpyrazine

图3 红火蚁工蚁对告警信息素标准样品混合物的GC-EAD 反应Fig.3 GC-EAD analysis of S.invicta workers to the synthetic alarm pheromone component mixture

3 讨论

本研究将大量红火蚁浸提液经硅胶柱层析分离，得到含告警信息素的流分，与2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪标准样品的气相色谱图保留时间对比，确定告警信息素流分含有2-乙基-3，6-二甲基吡嗪。将标准样品混合物进行GC-EAD 分析，红火蚁工蚁对2-乙基-3，6-二甲基吡嗪的电生理反应活性比对2-乙基-3，5-二甲基吡嗪的高。

由于告警信息素属于小分子易挥发物质，利用柱层析方法洗脱分离较难得到该组分，会让大量的物质挥发损失;另外，试验选用的红火蚁是冻死之后的工蚁，红火蚁在被冻死过程中可能会释放告警信息素，也会影响告警信息素的提取效率。因此，下一步可改进提取方法，如利用动态顶空吸附、固相微萃取等。另外，还可对已鉴定出来的告警信息素及一系列吡嗪类似物做电生理反应及行为反应测试，探讨吡嗪类似物对红火蚁行为的影响。

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