Gh relin对猪小肠上皮细胞增殖的影响

孔志伟，姜明鑫，郭 楠 ，杨文艳 ，杨连玉

（吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春 130118）

Ghrelin[1]是近年来新发现的由28个氨基酸组成的内源性肽，是迄今发现的惟一的生长激素促分泌激素受体（growth hormonesecretagogues receptor，GHSR）的天然配体。Ghrelin与其配体结合不仅能够促进垂体在体内和体外分泌生长激素[1-2]，而且还与采食行为以及能量代谢的平衡有关[3-7]。研究发现，外源性的Ghrelin能够提高小肠内外源性Ghrelin基因的表达。15μg/kg的胃内Ghrelin能够显著增强小肠内细胞的增值率，降低细胞凋亡率[8]，并且有研究显示结果与这一说法相一致[9-13]。小肠是食物进行消化、吸收的主要场所，研究Ghrelin对小肠上皮细胞生长发育的影响能够进一步了解Ghrelin代谢的过程。该试验通过体外培养的方法，对添加不同浓度梯度的Ghrelin对小肠上皮细胞的增殖情况进行分析，从而了解Ghrelin对猪小肠上皮细胞增殖的作用，为深入的研究Ghrelin对小肠上皮细胞影响的机制奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验仪器 分光光度计 (BIO RAD680，美国)；二氧化碳培养箱（SELECTA，西班牙）；倒置相差显微镜（Olympus，日本）；高压蒸汽灭菌锅（SAN⁃YO，日本）；超净工作台（SANYO，日本）；水平摇床(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司HZS-H)；鼓风干燥箱（上海申贤恒温设备厂）。

1.2 试验试剂 DMEM/F12培养基（GIBCO），胎牛血清（PAA），谷氨酰胺和胰蛋白酶均为AMRESCO产品；青霉素、链霉素均为Sigma产品；0.25%胰蛋白酶，胶原酶Ⅳ，MTT（Sigma）,二甲基亚砜（Sig⁃ma），Ghrelin（北京拜威佑生养殖管理咨询机构）。

1.3 细胞来源 试验所用细胞来自于动物生产与产品质量安全教育部重点实验室（吉林农业大学）。

1.4 试验方法

1.4.1 条件培养液的配制 配制Ph=6.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，然后将Ghrelin溶解其中配制成3×10-5mol/L的浓缩液，上述操作遵照Ghrelin说明书。用10%DMEM-F12溶液稀释上述浓缩液为1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L、1×10-10mol/L各10mL。保存在4℃冰箱中备用。

1.4.2 Ghrelin的添加 将传5代体外培养的小肠上皮细胞用0.25%胰酶消化，然后用含10%胎牛血清的培养液配成细胞悬液，接种于6个96孔板中，每孔200 μL，细胞浓度为2×104，培养箱中培养，24小时后取出一板，检测细胞同步化情况。共两个处理组：Ghrelin组和对照组。Ghrelin组加入终浓度为1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L、1×10-10mol/L的Ghrelin液，对照组仅有等量细胞液。各孔均补足培养液至200μL，37℃，5%CO2培养箱中培养。

分别于第1、3、5、7、9天各取出一板，于孔板内加入MTT 20μL，置于37℃，5%CO2培养箱中培养4 h，后取出96孔板，吸出培养液，每孔加入DMSO 50μL，在空白孔中加入DMSO 50μL作为空白对照，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。用分光光度计，选择490 nm波长，测定各孔的吸光值，记录结果，绘制细胞生长曲线。

2 数据处理与分析

采用SPSS17.0软件对试验数据进行方差分析和用LSD法进行两因素多水平间的多重比较，数据用均值±标准差表示。

3 结果

Ghrelin对猪小肠上皮细胞增殖的影响 试验组1×10-7mol/L浓度时在1～3 d时增殖较快（P＜0.01），刺激后第5天达到增值高峰（P＜0.05），1×10-6mol/L浓度时在3～5 d时增殖较快，其余各浓度组对猪小肠上皮细胞的增殖既无明显促进作用，也无明显抑制作用（见表1）。

表1 Ghrelin不同浓度处理组的细胞活性

图1 刺激后各浓度组细胞生长曲线

4 讨论

在人和鼠，Ghrelin的表达以胃组织中为最多，另在下丘脑、小肠、大肠、胰腺和胎盘等也有表达[14]。体外培养条件下,人和鼠Ghrelin均可直接刺激GH在猪垂体前叶细胞的释放[15]。研究Ghrelin的分泌规律及其作用机制，对于研究猪的生长调控等有着重要的作用。该试验在体外培养的条件下以传代培养的猪小肠上皮细胞（车东升等，2010[16]）为材料。参照苗艳颖等(2005)[17]、何红晨等(2006)[18]研究设计Ghrelin添加水平。该试验结果显示，在添加不同浓度Ghrelin时，1×10-6mol/L-1×10-7mol/L组的增殖效果显著（P＜0.05），细胞的数量也是最多，并且在第5天时达到增值高峰。而以往的研究显示，10-7～10-15mol/LGhrelin作用24 h能够明显促进前脂肪细胞的增殖[19]；10-7mol/LGhrelin能够显著促进胰岛素β细胞的增殖[20]，10-10mol/LGhrelin能够极显著的促进人成骨细胞的增殖[18]。Ghrelin对小肠的作用或许是由于外源性的Ghrelin促进了肠内Ghrelin的表达，从而调节生长激素的分泌，进而促进小肠上皮细胞的增殖；也或许是Ghrelin受体基因mRNA的表达增多，与外源性的Ghrelin作用，对小肠作用的Ghrelin量增多，间接的引起生长激素的分泌，引起肠上皮细胞的增殖；还可能是通过内分泌或者是旁分泌的形式作用于生长激素释放激素受体，从而促进小肠上皮细胞的增殖。近年来，对Ghrelin的研究逐渐增多，但是对于Ghrelin的分泌调节机制仍不清楚。

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