大鼠脊髓损伤椎管内蛛网膜下腔持续给药模型的建立＊

刘德华，王建，高志强，邹连生，张功亮（.赣南医学院第一附属医院神经外科，江西赣州 34000；.江西省赣州市人民医院病理科 34000）

脊髓损伤患者常遗留严重伤残，导致日常生活困难，给家庭和社会造成极大负担，而且发病率在全球呈现逐渐上升的趋势。因此，脊髓损伤后的治疗研究已成为全球共同关注的课题。有必要建立一种稳定且重复性好、与临床脊髓损伤类型相似的动物模型，为后期的脊髓损伤治疗提供实验基础。本实验利用Allen法制备急性挫伤型动物模型，模拟临床上外伤所致的脊髓损伤，并在损伤灶安装蛛网膜下腔持续给药装置，观察大鼠的行为表现及给药装置的效果，为进一步治疗研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料选取健康Wistar大鼠30只，清洁级，体质量250～316g，平均（280.1±15.17）g，由赣南医学院实验动物中心提供，雌雄不限。动物按体质量从小到大编号，按随机数字法将这些动物等分为实验组和对照组。注药导管取自一次性使用静脉输液针（江西洪达），穿刺囊取自一次性使用无菌注射器（1mL，江西三鑫）。

1.2 方法大鼠用0.15%水合氯醛腹腔注射（按300mg／kg计算），麻醉成功后，将大鼠俯卧位固定于手术台上。消毒术区皮肤，取T8～T12节段腰背部正中入路，逐层切开皮肤、皮下组织至脊柱，暴露T9～T11节段，用手外科持针器咬开T9～T11节段椎板至两侧关节突，充分暴露脊髓。采用Allen重物坠落法，将10g砝码由25mm 高度沿玻璃管坠落打击大鼠开放的T10节段脊髓［1－2］；大鼠出现摆尾反射、双后肢及躯体回缩扑动后双后肢瘫痪。显微镜下，将大鼠T10节段脊髓损伤处的硬脊膜及蛛网膜剪开，将导管头端剪成30°角斜面，10倍显微镜下与硬脊膜行端侧吻合（导管与椎管纵轴相一致）。参考杜世伟等［3］的方法，取1 mL 注射器的筒状橡胶塞（长5.0 mm）作为穿刺囊（经实验其底面可反复穿刺而不出现液体渗漏），将导管末端插入穿刺囊内（两者管径接合紧密，为防止术后脱落用医用胶水粘合固定），形成一末端保护装置缝合于背部皮下筋膜上。彻底止血后逐层缝合肌肉、皮肤。对照组同法暴露脊髓，植入注药装置，但不损伤脊髓。各组于术后1h 经腹腔给予每千克2万单位青霉素，每日2次，连续3d。均自由饮食。每日膀胱区按压排尿3次至大鼠反射性膀胱形成。

1.3 截瘫动物的饲养及护理截瘫大鼠术后颈部佩戴硬塑料颈套以防自残，分笼饲养于配有空调（室温21～24℃，湿度55%～65%）、环境安静的专用饲养室，配备充足的饲料、水分，及时更换垫料，保持笼内清洁。每天按时行2次人工排尿，排尿前先清理尿道口，保持外尿道通畅，排尿时手指轻按充盈的膀胱，逐渐加压，见有尿排出后保持压力，排出大部分尿液即可（无需完全排尽尿液，以免挤破膀胱）。排尿后可适当挤压直肠帮助排便；排便排尿后要及时清理，保持大鼠会阴部干燥，被尿液浸湿的肢体用温肥皂水清洗，吹干；常改变体位，适当牵拉双下肢，帮助运动。

1.4 大鼠后肢运动功能评分采用后肢运动功能评分法（BBB）［3－4］，将大鼠后肢运动分为22个等级。后肢全瘫为0分，完全正常为21分，两者之间根据功能分别定为1～20分，其基本内容为：关节活动的数目和范围，负重程度及前后肢协调性，前、后爪和尾部的活动情况。BBB评分观察期4min，动物应尽量保持在活动范围的中心区域活动，分别对大鼠术后24h、3d、1周、2周、4周进行评分。评分采用双人双盲法，取两人评分均值作为每次记录值。BBB 评分小于或等于7分定义为运动功能严重损伤；大于或等于15分定义为运动功能基本恢复：2次BBB评分增长大于或等于5分定义为运动功能恢复显著。麻醉苏醒后BBB 评分0分则表明脊髓损伤模型造模成功。

1.5 导管性能检测在术后第1、3、7、14、28天分别进行脑脊液置换术，检测导管性能。在体外触摸注射囊位置，用1 mL注射器经皮穿刺囊底，有明显落空感后，抽出0.1 mL 脑脊液检测脑脊液中葡萄糖水平，随后注入0.1ml无菌生理盐水置换，1h后再抽出0.1mL脑脊液检测脑脊液中葡萄糖水平［5］。抽液及注液均流畅以及两次抽取液中含有葡萄糖接近脑脊液中水平则证明导管通畅性能正常；如果两次抽取液葡萄糖水平明显减少或两次检测结果相差悬殊，说明导管脱落或堵塞。

1.6 统计学处理采取SPSS 12.0统计学软件进行数据分析；计量资料以表示，组间比较用t检验；以α＝0.05为检验水准，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 术后一般情况观察30只大鼠均造模成功，脊髓损伤实验组大鼠麻醉清醒后均表现为双后肢截瘫，损伤平面以下肌张力降低，肌力0级，对针刺亦无反应，并明显尿潴留。对照组大鼠四肢活动正常。术后前3d，大鼠活动较少，进食少，体质量有所下降，尿潴留现象比较严重，常伴有轻微血尿及腹部胀气，部分大鼠有大便困难伴硬结。第4天后，饮食逐渐增加，体质量增加，部分大鼠恢复自动排便，尿潴留现象有所改善，但仍需挤压膀胱帮助排尿。经过精心护理，所有大鼠均未出现切口感染现象。1只大鼠在术后2d死亡，2只大鼠表现为痉挛性瘫痪，2只大鼠导管脱落或堵塞（植入装置穿刺抽取液中葡萄糖含量极低），6只大鼠表现出不同程度的自残现象。

2.2 BBB运动功能评分及抽取液葡萄糖含量检测结果实验组各时间段BBB评分均明显低于对照组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。实验组与对照组各时间段抽取液葡萄糖含量检测结果，24h为（2.33±0.29）mmol／L、3d为（2.05±0.24）mmol／L、1周为（2.27±0.26）mmol／L、2周为（2.43±0.37）mmol／L、4周为（2.47±0.41）mmol／L。

表1 两组各时间段BBB运动功能评分比较（，分）

表1 两组各时间段BBB运动功能评分比较（，分）

3 讨论

随着人类社会现代化的进程，脊髓损伤的发病率在全球呈现出逐渐上升的趋势。脊髓损伤者常遗留严重伤残，引起损伤段以下感觉运动功能丧失，出现截瘫或四肢瘫，导致日常生活困难，给家庭和社会造成极大负担［6］。因此，脊髓损伤后的康复治疗是医患双方迫切需要解决的问题。为寻求治疗脊髓损伤的有效方法，需要建立与临床脊髓损伤类型极为相似的动物模型，评估脊髓损伤严重程度及有效治疗的方法，为进一步脊髓损伤的治疗提供实验依据。

脊髓损伤阶段性越高，实验大鼠病死率及并发症越高，目前广泛使用脊髓T8～T12阶段为实验损伤部位，而且胸段脊髓椎板咬处相对方便［1］。因此，本实验参照Allen重物坠落法制作大鼠T10节段脊髓损伤模型，总体实验数据比较稳定，重复性较高。伤后3d至1周之间BBB评分明显升高，运动功能恢复显著，1周后运动功能恢复不明显，说明大鼠损伤1周内有自我修复能力，1周后渐趋稳定［7－8］。本研究脊髓损伤模型术后表现为痉挛性瘫痪2只，2d后死亡1只，说明这种实验方式仍存在着一定缺陷，比如外力作用时间不恒定、脊髓损伤不对称、损伤范围不恒定等。在无脊髓损伤的对照组BBB 评分仍未达到正常，主要原因考虑为：（1）手术咬除椎板或剪开硬膜时有可能损伤脊髓；（2）植入注药装置后，导管对脊髓的影响作用［9］。轻柔细致的显微手术操作，以及选取更为柔软的导管可能会改善实验结果，待进一步实验证实和改进。

检测植入注药装置通畅性，通常是向蛛网膜下腔注射利多卡后观察大鼠双下肢麻痹、瘫痪症状［10］；以及一定时间内能否恢复下肢活动能力，以此判定位于蛛网膜下腔内的导管是否通畅，而对于脊髓损伤已经有下肢活动障碍的实验动物显然是不合适的。本实验采取检测注药装置球囊内液体的含糖量来判断导管是否与蛛网膜下腔相通，获得了成功，而且检测方便可靠。通过此方法判断2只大鼠导管脱落或堵塞，后经解剖证实导管与硬脊膜吻合口撕裂脱落，与蛛网膜下腔不通。

总之，动物模型对促进实验干预治疗的发展必不可少，并将继续在脊髓损伤治疗研究中起到十分重要的作用。探索一种全新的、更加合理有效、稳定性好、可重复性强、性状稳定、便于护理的脊髓损伤持续椎管内注药模型，为脊髓损伤的理论研究奠定了基础。

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