HPLC法同时测定怡心颗粒中丹参素和甘草酸的含量＊

考玉萍 付立明 刘满军 袁秋贞 陕西省中医医院（西安710003）

怡心颗粒为中药复方制剂，系由柴胡、白芍、当归、远志、石菖蒲、五味子、炒酸枣仁、丹参、夜交藤、茯苓、生龙骨、生牡蛎、磁石、甘草组成。它是在古方逍遥丸［1］的基础上加入炒酸枣仁、生龙骨、磁石等中药组成，主要用于治疗肝郁脾虚所致的郁闷不舒，食欲减退、失眠等病症，经临床使用疗效肯定。为有效控制该制剂的质量，本文采用多波长－高效液相色谱法建立了同时测定怡心颗粒中丹参素及甘草酸二种成分的含量测定方法，结果表明，本法简便，专属性强，重复性好，为控制怡心颗粒质量提供科学依据。

1 仪器与材料1.1 仪 器 Waters2695高效液相色谱仪（美国沃特斯），2996紫外检测器（美国沃特斯）；Empower色谱工作站，GB204电子天平（瑞士梅特勒托利多，精密度0.01mg）；超声清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号SB－3200D，180W，40KHz）。

1.2 材 料 怡心颗粒（院内制剂，批号：20110801、20111002、20111011）；丹参素钠对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：110855－200506）；甘草酸铵对照品（中国药物生物制品鉴定所，批号：110731－200513）。乙腈（色谱纯，美国Fisher公司），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取丹参素钠、甘草酸铵对照品各1.70mg、2.25mg，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 取怡心颗粒10mL，用水饱和正丁醇萃取3次，每次30mL，合并正丁醇萃取液，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至10mL量瓶，摇匀，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件 色谱柱：Accurasil C18（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序为0～15min（5%～11.5%A），15～20min（11.5%～13%A），20～25min（13%～5%A），25～30min（15%～20%A），30～50min（20%～25%A），50～60min（25%～40%A），60～70min（40%～45%A），70～75min（45%～55%A）；流速1.0mL·min－1；检测波长：丹参素钠286nm，甘草酸铵252nm；柱温：35℃；进样量：10μL。在上述色谱条件下丹参素钠、甘草酸铵对照品溶液和怡心颗粒供试品溶液高效液相色谱图，见图1。

图1 怡心颗粒高效液相色谱图

2.4 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液2.5、5、7.5、10、15、20μL按“2.3”项下色谱条件进样，测定峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。丹参素钠和甘草酸铵回归方程分别为 Y＝5.7401×104X－9409.8，r＝0.9987；Y＝7.9735×104X＋15371，r＝0.9989。结果表明：丹参素钠和甘草酸铵分别在0.212～1.701μg·mL－1、0.0563～0.451μg·mL－1与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，按照“2.3”项下色谱条件重复进样6次，测定峰面积，计算得丹参素钠和甘草酸铵峰面积的RSD分别为1.56%、2.22%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批号样品（批号：20110801）6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算得丹参素钠和甘草酸铵峰面积的RSD分别为2.21%、0.95%，表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一样品（批号：20110801）溶液，室温放置，按“2.3”项下色谱条件，于0、2、4、8、12、24h进样，测定峰面积，计算得丹参素钠和甘草酸铵峰面积的RSD分别为2.84%、2.72%。表明供试品溶液在室温放置24h内稳定。

2.8 回收率试验 精密量取已知含量的样品（批号：20110801）5.0mL，置10mL量瓶中，分别精密加入丹参素钠0.470mg，甘草酸铵0.143mg，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按照“2.3”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收率试验

2.9 样品测定 精密量取3份不同批次的样品适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，参照“2.3”项下色谱条件依次进样分析，测定峰面积，计算丹参素钠和甘草酸铵的含量，再由丹参素钠和甘草酸铵对照品折算得到丹参素和甘草酸的含量，结果见表2。

表2 丹参素、甘草酸含量测定结果

3 讨论与结论3.1 测定指标的选择 怡心颗粒为逍遥丸加入炒酸枣仁、磁石等中药，经提取纯化等工艺加工而成的中药复方制剂，为我院多年临床经验方，具有抗抑郁、抗焦虑、改善睡眠等疗效。2010版《中国药典》中，逍遥丸及逍遥颗粒的含量检测指标均为芍药苷［2］，但作为中药复方制剂，单一成分并不能很好控制其质量，因此，本文采用HPLC法同时测定丹参素［3］及甘草酸的含量，以控制该制剂的质量。

由于丹参素和甘草酸对照品不易结晶，很难得到，而丹参素钠和甘草酸铵对照品易结晶，在提取，精制等方面相对容易，可得较高纯度。因此，本实验采用丹参素钠和甘草酸铵对照品折算丹参素与甘草酸的含量。

3.2 检测波长选择 实验过程中，我们采用紫外检测器进行全波长扫描，结果各化学成分响应值分别出现在不同位置。如丹参素钠在286nm处有最大吸收，而甘草酸铵在252nm处有最大吸收，与参考文献资料相符合［4，5］，因此，最终选择了多波长进行检测。

3.3 流动相选择 该样品为中药复方制剂，化学成分复杂，化合物极性差异较大，预实验过程中曾尝试采用甲醇－水、乙腈－水、乙腈－磷酸溶液为流动相，进行梯度洗脱［6］。结果发现水相中加入少量酸可减少拖尾、提高灵敏度，考虑色谱柱的保护采用0.1%磷酸水作为水相。故最终确定流动相为乙腈－0.1%磷酸水系统梯度洗脱。结果显示，该条件下测定，各色谱峰分离度高、峰形好、理论塔板数高。

［1］国家药典委员会.中国药典.一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：256.

［2］梁晓东，时秀英.HPLC法测定逍遥丸中芍药苷的含量［J］.亚太传统医药，2011，10（10）：27－29.

［4］张 克.HPLC法测定盖艾康胶囊中甘草酸含量［J］.中医研究，2011，24（4）：20－22.

［5］屈 蓉，仇雅静，陈骁鹏，等.高效液相色谱法测定心可舒片中丹参素钠和原儿茶醛含量［J］.中国药业，2012，21（19）：23－24.

［6］李会娟，张 宁.逍遥散高效液相色谱指纹图谱的研究［J］.中成药，2011，33（6）：913－916.