基于液态黑脉羊肚菌菌丝体培养基配方的研究*

聂建军，潘保华，李彩萍，徐全飞，牛 宇，张 博

(1.山西省农业科学院农业资源与经济研究所，山西 太原 030006;2.山西省农业科学院农业环境与资源研究所，山西 太原 030006;3.首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京 100038)

羊肚菌Morchella eulenta(L.)Pers.，属子囊菌亚门(Abcmycotina)、盘菌目 (Peziales)、马鞍菌科 (Helvellaceae)、羊肚菌属 (Morehella)。具有降血脂、调节机体免疫力、抗疲劳、抗病毒、抑制肿瘤、减轻放化疗引起的毒副作用等功效。羊肚菌属共有28种，我国现有12种，主要分布于甘肃、青海、新疆、内蒙古、山西、河北、四川，云南等地。其中的佼佼者黑脉羊肚菌菌帽大、肉质厚、菌柄短小、帽黑柄白、尖型饱满、大小匀称、气味香浓，子实体中的钾、钙、镁、铁以及人体容易缺乏的微量元素锌的含量非常高，深受国内外消费者的欢迎。目前的技术还无法实现黑脉羊肚菌大规模的商业化栽培，而且野生资源极分散，数量非常少，国内外市场有价无货。据报道，羊肚菌菌丝体和子实体营养成分相差无几，甚至菌丝体中赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等含量比子实体还高[1－4]。为了开发利用这一宝贵资源，笔者对黑脉羊肚菌菌丝体在液态环境中培养基配方进行了研究，旨在为其菌丝体或相关产品的生产开发提供理论依据和技术支撑。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

黑脉羊肚菌菌株Hm01，从采自山西省关帝山的野生子实体组织分离纯化培养后所得。

1.2 培养基

母种培养基:PDA培养基。

活化培养基[5]:CPDA培养基。

基础培养基:KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%、VB110 mg·L－1。

碳源培养基:基础培养基，加入葡萄糖、蔗糖、玉米粉、乳糖、可溶性淀粉、麦芽糖各2%及蛋白胨1%。

氮源培养基:基础培养基，加入蛋白胨、酵母浸膏、硝酸钾、硫酸铵、尿素、黄豆粉各1%及葡萄糖2%。玉米粉和黄豆粉加水煮沸30 min，5层纱布过滤。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化与纯化培养

将黑脉羊肚菌菌种从冰箱中取出后，25℃下恒温放置3 d，使处于低温中的菌种活化;无菌条件下把活化菌种接种于CPDA培养基平板上，25℃下恒温培养2 d～3 d之后挑取强壮菌丝前端，接种于斜面母种培养基上，25℃下恒温培养至斜面长满，得实验用菌种备用。

1.3.2 碳 (氮)源筛选试验

挑取1 cm2实验用黑脉羊肚菌菌种，分别接种于6种不同碳 (氮)源培养基中，500 mL三角瓶装液体培养基100 mL，使气生菌丝一面向上悬浮，25℃下静置24 h;然后放入往复式恒温振荡器内，26℃，140 r·min－1条件下培养6 d。每种碳 (氮)源试验重复5次，结果取平均值。

1.3.3 正交试验筛选液体培养基配方

把筛选出的最佳碳源、最佳氮源与 MgSO4·7H2O、KH2PO4组成正交试验9个不同处理的培养基，培养条件同1.3.2，筛选出液体培养基最佳配方。每个处理重复5次，结果取平均值[6]。试验因素及其各水平见表1。

表1 L9(34)正交试验的因素及水平

1.4 测定方法

生物量的测定:取培养好的菌丝体液在3 000 r·min－1的条件下离心10 min，蒸馏水洗涤，再离心，倒去上清液，菌丝体在60℃下烘干至恒重，称量。

2 结果与分析

2.1 碳源筛选试验结果

碳源筛选试验结果见表2。

表2 不同碳源对黑脉羊肚菌菌丝体的影响

从表2可以看出，可溶性淀粉作为碳源，生长的菌丝体呈浅黄色、丝状，经取样、稀释、镜检，菌液是由分布着数量巨大的断裂菌丝体片段所组成的溶液，其菌丝体生物量最高，达9.85 g·L－1;对比其它5种碳源生成的菌丝体生物量差异达极显著，因此，可溶性淀粉作为黑脉羊肚菌菌丝体液体培养基碳源效果最佳，其次是玉米粉、葡萄糖等。

2.2 氮源筛选试验结果

氮源筛选试验结果见表3。

表3 不同氮源对黑脉羊肚菌菌丝体的影响

从表3可以看出，有机氮源优于无机氮源，但尿素不能被很好地利用。酵母浸膏作为有机氮源，生成的菌丝体呈浅褐色、丝状，其菌丝体生物量最高，达8.34 g·L－1，对比其它5种氮源生成的菌丝体生物量差异达极显著，因此，酵母浸膏作为黑脉羊肚菌菌丝体液体培养基氮源效果最佳，其次是黄豆粉、蛋白胨等。

2.3 正交试验筛选黑脉羊肚菌液体培养基结果

L9(34)正交试验结果与极差分析见表4。

表4 培养基配方正交试验结果

从表4可以得出，影响黑脉羊肚菌菌丝体生物量的因素依次为A＞D﹥B﹥C，即可溶性淀粉﹥MgSO4·7H2O﹥酵母浸膏﹥KH2PO4;黑脉羊肚菌菌丝体液体培养基最佳组合为A2B1C3D2，即可溶性淀粉3%、酵母浸膏0.5%、KH2PO40.3% 、MgSO4·7H2O 0.1% 。

3 结论

通过筛选试验发现，黑脉羊肚菌菌丝体液体培养基最佳碳源是可溶性淀粉，最佳氮源是酵母浸膏。可溶性淀粉作为黑脉羊肚菌菌丝体液体培养基的碳源，一方面可以作为碳营养被吸收和利用，另一方面前期可以作为增稠剂来提高培养液黏度，增加菌丝体数量，到后期可溶性淀粉被消耗而使培养液变稀，这样的菌种接到固体培养基上透气性好，有利于菌种萌发和吃料。

采用正交试验方法筛选黑脉羊肚菌菌丝体液体培养基配方，结果表明，黑脉羊肚菌菌丝体液体培养基最佳配方为可溶性淀粉 3%、酵母浸膏 0.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、KH2PO40.3%、VB110 mg·L－1。

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