产气肠杆菌持续高产型AmpCβ-内酰胺酶的产生与抗菌药物应用关系的研究

赵付菊， 方 毅， 张景皓， 刘文健， 周丽芳， 庞立峰， 赵 虎

(复旦大学附属华东医院检验科，上海200040)

染色体编码产生AmpCβ-内酰胺酶(简称AmpC酶)的某些菌株，在β-内酰胺类抗菌药物作用后通过引发或筛选去阻遏突变株的方式发生AmpC酶的高表达，引起临床抗感染治疗的失败，甚至出现体外药物敏感性试验敏感而临床抗感染治疗无效的现象，增大了临床抗感染治疗的难度［1］。产酶菌株易在长期住院或接受侵入性诊疗及老年病患者和医疗器械中形成定植，导致不同程度的医院内传播和流行［2］。我们前期对华东医院临床常见革兰阴性杆菌产AmpC酶情况调查分析显示，以铜绿假单胞菌和产气肠杆菌的持续高产型AmpC酶菌株分离率最高，其次为阴沟肠杆菌和鲍曼不动杆菌［3］。现为进一步探索抗菌药物使用种类和剂量与菌株持续高产型AmpC酶的相关性，了解其它可能相关的临床危险因素，本研究选择华东医院持续高产型AmpC酶阳性率最高的产气肠杆菌感染的病例为研究对象，进行前瞻性和回顾性分析。

材料和方法

一、菌株来源及研究对象的确立

收集分离自华东医院老年病区2011年9月至2012年3月住院患者的痰液、尿液、胆汁等标本中耐头孢西丁的产气肠杆菌19株。选择感染产野生型和持续高产型AmpC酶的产气肠杆菌的临床病例为研究对象，对感染产野生型AmpC酶的产气肠杆菌的临床病例进行前瞻性研究，对感染产持续高产型AmpC酶的产气肠杆菌的临床病例进行回顾性调查。

二、细菌培养鉴定和药物敏感性分析

根据《全国临床检验操作规程》(第3版)，按常规方法进行细菌培养、分离。采用 Vitek2 Compact全自动微生物分析系统(法国生物梅里埃公司)对所分离的菌株进行鉴定。血琼脂、中国蓝和水解酪蛋白胨平板为上海科玛嘉微生物技术有限公司产品，药物敏感性纸片购自英国Oxiod公司。质控菌株:大肠埃希菌(ATCC 25922，上海市临床检验中心)、肺炎克雷伯菌(ATCC 700603，南京便诊生物科技有限公司)、阴沟肠杆菌029和阴沟肠杆菌029M(由华山医院蒋晓飞教授惠赠)。

对感染产野生型AmpC酶的产气肠杆菌的临床病例持续收集其临床标本，分离培养细菌并进行体外药物敏感性试验。若再次分离出产气肠杆菌，并发现其产酶类型发生变化(由野生型转变为持续高产型)，则分析前后2株细菌的同源性。

三、改良三维试验分析产酶类型

参考胡付品等［4］报道，采用反复冻融法制备粗提酶，经0.22μm的无菌滤膜过滤除菌后－20℃保存，阴沟肠杆菌029M和029分别作为AmpC酶阳性和阴性对照，肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)作为超广谱 β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamase，ESBLs)阳性对照。将0.5麦氏单位的大肠埃希菌(ATCC 25922)涂布于水解酪蛋白胨平板上，在平板中央贴一张头孢曲松纸片，从距离纸片5 mm处切4条裂隙并编号，①号加入30μL酶粗提液，②号加入30μL酶粗提液和10μL 4 mmol/L的氯唑西林溶液，③号加入30μL酶粗提液和10μL 2 mmol/L的克拉维酸溶液，④号加入30μL酶粗提液、10μL 2 mmol/L的克拉维酸溶液和10μL 4 mmol/L的氯唑西林溶液。37℃培养18 h，若裂隙与头孢曲松纸片交界处出现矢状的细菌生长区域者判为三维试验阳性，反之则为阴性;①②阳性而③④阴性为单产ESBLs，①③阳性而②④阴性为单产AmpC酶，①②③阳性而④阴性为产ESBLs+AmpC酶菌株，即SSBLs菌株，①②③④全部阳性为产其他水解酶，全部阴性为不产酶菌株。

四、脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)分析菌株同源性

布伦邓禄普沙门菌H9812(上海市疾病预防控制中心提供)为标准菌株。配制细胞悬浮液(100 mmol/L Tris:100 mmol/L乙二胺四乙酸，pH值8.0)，用灭菌棉签挑取平板上分离自同一患者不同时期且产酶类型发生变化的2株产气肠杆菌，制成均匀的细菌悬液，调整浓度至4麦氏单位。取200μL细菌悬液和10μL 20 mg/mL蛋白酶K混合，取50℃水浴中的1%Seaken Gold琼脂糖凝胶200μL混匀制成胶块。胶块凝固后将其置于 5 mL的细胞裂解液 CLB与25μL 20 mg/mL蛋白酶K混合液中，50℃轻振荡3 h。用水洗胶2次，用Tris-乙二胺四乙酸缓冲液洗4次。最后将胶块置5 mL Tris-乙二胺四乙酸缓冲液中，4℃保存。切2 mm宽的胶块置于含30μL ApaⅠ酶的酶切缓冲体系中，37℃酶切3 h。配制1%Seaken Gold琼脂糖凝胶160 mL，置于54℃的水浴中，将酶切后的胶块按序排列在样品梳对应位置，将琼脂糖缓慢倒入模具中，凝固后，拔出样品梳，将胶块置入电泳槽中。电泳条件:电压6 V/cm，电泳时间 16 h，脉冲参数 0.22～18 S，120°，电泳温度14℃。电泳结束后，Gelred染色，用荧光成像仪读胶分析。

五、资料收集

主要病例资料收集包括患者年龄，基础疾病，标本来源，感染菌株前30 d抗菌药物使用的种类、剂量及疗程，体外药物敏感性试验结果和改良三维试验结果。

六、统计学方法

运用WHONET 5软件和SPSS16.0软件进行数据分析，采用χ2检验进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、持续高产型AmpC酶产酶率和产酶类型分布

收集产气肠杆菌19株，6株单产持续高产型AmpC酶，阳性率为31.58%;野生型AmpC酶5株，阳性率为26.32%;3株为SSBLs，阳性率为15.79%;5株为产其他水解酶，占26.32%。选择单产持续高产型AmpC酶菌株和产野生型AmpC酶菌株共11株为目的菌株，11株菌中包括同一患者来源但不同时期分离的2株产气肠杆菌，1株为产野生型AmpC酶菌株，另1株为单产持续高产型AmpC酶菌株。

二、感染患者的临床特点

10例患者分布在普外科2例，综合内科2例，肾内科2例，及其他4个病区各1例;主要为高龄患者，平均年龄为84岁，9例患有3种及3种以上基础疾病;检出标本以痰标本为主，共6例，尿标本3例，胆汁和脓液标本各1例，痰和尿标本产酶类型分布见表1。

表1 痰和尿标本产酶类型分布 ［例(%)］

三、菌株同源性鉴定

运用PFGE分析2株来源同一患者不同时期的产酶类型不同的产气肠杆菌的同源性，结果显示同源性一致，见图1。

图1 产气肠杆菌PFGE结果的树状图

四、菌株的药物敏感性试验

11株产气肠杆菌，比较持续高产型AmpC酶组和野生型AmpC酶组药物敏感性试验结果，其中持续高产型AmpC酶组对头孢他啶和头孢呋辛的敏感性明显低于野生型AmpC酶组，其他无明显差异。见表2。

表2 11株持续高产型和野生型AmpC酶产气肠杆菌药物敏感性试验结果

续表1

五、抗菌药物应用

10例患者中，有1例患者不同时期分离出产酶类型不同的2株产气肠杆菌，初次分离为野生型，15 d后其产酶类型转变为持续高产型，这期间患者具体用药:替考拉宁2.0 g/次，2次/d，共用13 d;头孢米诺钠2.0 g/次，2 次/d，共用 13 d。另外9例患者感染前30 d抗菌药物使用情况:5例感染产持续高产型AmpC酶菌株患者中，2例未曾使用任何抗菌药物，4例感染产野生型AmpC酶菌株患者中有1例未曾使用任何抗菌药物。其他6例患者药物使用情况见表3。

表3 患者感染持续高产型和野生型AmpC酶产气肠杆菌前30 d内抗菌药物使用情况

讨 论

AmpC酶是一种丝氨酸活性蛋白酶，Ambler分子结构学分类属C类，Bush-Jacoby-Medeiros功能学分类属于1组［5］，主要由染色体介导，部分由质粒介导，能水解大部分β-内酰胺类抗菌药物如广谱青霉素、头霉素及头孢菌素等，且不易被β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸及舒巴坦所抑制。染色体介导表达AmpC酶的细菌主要是肠杆菌科细菌，如阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、黏质沙雷菌、产气肠杆菌、普罗威登斯菌等，其他非肠道来源的革兰阴性菌如铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌也有表达。正常情况下，AmpC酶表达呈低水平，当β-内酰胺抗菌药物作用后可能引起AmpC酶表达水平提高，部分可在抗菌药物因素去除后酶表达恢复正常，部分因去阻遏突变则引起AmpC酶持续高表达，成为产持续高产型AmpC酶菌株。

本研究中，19株产气肠杆菌单产持续高产型AmpC酶阳性率为31.58%，明显高于国内林奇龙等报道［6］，因菌株分离自不同病区，产酶菌株引起医院交叉感染的可能性较小，故华东医院老年病房持续高产型AmpC酶产酶率高并非交叉感染所致。标本来源以痰标本和尿标本为主，痰标本分离的持续高产型AmpC酶菌株占83.33%，尿标本来源的占33.33%，提示持续高产型菌株分离率可能与感染部位有关［1］;药物敏感性结果显示，持续高产型组菌株对第3代以下头孢菌素耐药率显著高于野生型菌株;感染病例均为高龄且多患3种以上基础疾病的患者，结合文献报道，第3代头孢菌素在治疗肠杆菌科细菌引起的菌血症和脑膜炎时，即使药物敏感性试验为敏感，临床治疗仍然无效［7］，提示临床治疗高龄患者呼吸道来源的产气肠杆菌时慎用或避免使用第3代以下的头孢菌素及头霉素类抗菌药物。

β-内酰胺类药物可引发持续高产型AmpC酶的表达，不同的β-内酰胺类药物的引发能力也有所差异，青霉素、阿莫西林和头孢菌素类药物如头孢唑啉是AmpC酶表达的强引发剂，头孢西丁和亚胺培南对AmpC酶的表达也有很强的引发作用［8］。本研究中，对比2组抗菌药物的使用情况，持续高产型组单药治疗剂量和天数明显高于野生型组。前瞻性研究同一来源不同时期产酶类型发生转变的2株菌用药情况，患者联合使用糖肽类及头霉素药物13 d后产酶类型发生改变，结合持续高产型组与野生型组单用头霉素药物剂量，提示治疗产气肠杆菌感染时头霉素类药物使用2周以上易引发持续高产型AmpC酶菌株产生。单用美罗培南治疗或头孢他啶治疗应注意疗程，避免细菌耐药酶的产生。目前细菌耐药现象严重，喹诺酮类和碳青霉烯类药物存在筛选出多重耐药菌的可能，治疗产气肠杆菌等肠杆菌科细菌感染推荐使用哌拉西林-他唑巴坦［1］。另外，持续高产型组中有2例未曾使用任何药物，考虑可能为质粒介导AmpC酶持续高产引发细菌耐药。

［1］Harris PN，Ferguson JK.Antibiotic therapy for inducible AmpC β-lactamase-producing Gram-negative bacilli:what are the alternatives to carbapenems，quinolones and aminoglycosides［J］.Int J Antimicrob Agents，2012，40(4):297-305.

［2］Yoo JS，Byeon J，Yang J，etal.High prevalence of extended-spectrum beta-lactamases and plasmidmediated AmpC beta-lactamases in Enterobacteriaceae isolated from long-term care facilities in Korea［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2010，67(3):261-265.

［3］赵付菊，刘文健，韩海燕，等.老年患者医院感染前五位常见革兰阴性杆菌ESBLs和AmpCβ-内酰胺酶分析［J］.老年医学与保健，2013，19(3):158-160.

［4］胡付品，朱德妹，汪 复，等.2011年中国CHINET细菌耐药性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2012，12(5):321-329.

［5］Bush K，Jacoby GA，Medeiros AA.A functional classification scheme for beta-lactamases and its correlation with molecular structure［J］. Antimicrob Agents Chemother，1995，39(6):1211-1233.

［6］林奇龙，陈琼娜，方国安，等.94株产气肠杆菌的临床分布与耐药性分析［J］.中华医院感染学杂志，2012，22(16):3658-3660.

［7］Chow JW，Fine MJ，Shlaes DM，etal.Enterobacter bacteremia:clinical features and emergence of antibiotic resistance during therapy［J］.Ann Intern Med，1991，115(8):585-590.

［8］Jacoby GA.AmpC beta-lactamases［J］.Clin Microbiol Rev，2009，22(1):161-182.