巴西蘑菇与双孢蘑菇菌丝体抗氧化活性和多糖含量的比较

2014-11-20翟飞红王琳琳韩建荣

食品与发酵工业 2014年10期

翟飞红，王琳琳，韩建荣

1(山西大学生命科学学院，山西太原，030006)

2(北京中医药大学东方学院渤海校区，河北沧州，061108)

巴西蘑菇(Agaricus blazei)，其商品名又为“姬松茸”。其子实体富含多种有效成分，尤其是其子实体多糖，具有抗病毒、抗肿瘤等作用［1－2］。双孢蘑菇(Agaricus bisporus)为蘑菇属的著名食用菌，因其担子上通常着生2个担孢子而得名。双孢蘑菇肉质肥厚，味道鲜美且热能低，具有很好的医疗保健作用［3］。

巴西蘑菇与双孢蘑菇同属于蘑菇属，两者在栽培方法和技术上基本相似。除了其子实体可以利用外，还可以对其菌丝体的发酵产物加以利用。目前，已有文献表明两者的子实体均有抗氧化活性［4－6］，对于菌丝体的研究主要集中在液态发酵条件的摸索及氧胁迫条件下菌丝体的生长状况［7－8］，而对其液态发酵菌丝体多糖含量和抗氧化活性的研究较少。本文研究了巴西蘑菇和双孢蘑菇经液态发酵获得的菌丝体的多糖含量和抗氧化活性，为开发利用两种菌的菌丝体提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 菌种

巴西蘑菇(Agaricus blazei)和双孢蘑菇(Agaricus bisporus)由本实验室提供，保存于马粪琼脂培养基中。

1.2 液态培养基［9］

采用玉米黄豆培养基，配方为:玉米粉20.0 g，黄豆粉10.0 g，酵母粉 2.0 g，蔗糖 20.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO31.0g，(NH4)2SO41.0 g，蒸馏水1 000 mL。

1.3 试剂

DPPH(1，1－二苯基苦基苯肼)，由 Sigma公司生产;Ferrozine(菲洛嗪)，由美国 BBI公司生产;BHT(2，6－叔丁基－4－甲基酚)，由英国的 Avocado Research Chemicals 公司生产;K3Fe(CN)6、NaH2PO4、Na2HPO4、FeCl3、FeCl2、甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、EDTA－Na2、核黄素、苯酚、酒石酸钾钠、Na2SO3和3，5－二硝基水杨酸(DNS)，均为国产分析纯。

1.4 菌丝球的收集与处理

将贮藏的巴西蘑菇和双孢蘑菇菌种切块接种于PDA培养基上进行活化，将活化后的斜面菌种分别切成1 cm×1 cm的小块，接种于装有50 mL液态培养基的250 mL三角瓶中，每瓶接种5块。接种后在室温下放置48 h，然后于25℃、150 r/min摇瓶培养7 d。发酵完毕后，过滤收集菌丝球，并用蒸馏水清洗收集到的菌丝球2次。然后将菌丝球置于培养皿中，60℃烘干至恒重，置于密封瓶中备用。

1.5 抗氧化性物质的提取

准确称取10 g干燥后的菌丝体，置于研钵中研磨，然后分别加入100 mL的80%乙醇溶液，于25℃、130 r/min的摇床上提取24 h，抽滤，取滤液，滤渣在相同的条件下复提，合并2次滤液。滤渣烘干后称重，计算提取率与初始浓度;滤液在40℃下旋转蒸发，得到浓缩液，然后用体积分数80%的乙醇溶液定容，待测。

1.6 抗氧化性的测定

1.6.1 DPPH·清除能力［10］

DPPH·是一种稳定的自由基，其乙醇溶液为紫色，在517 nm处有最大吸收峰。当往DPPH溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色会变浅，OD值变小。OD值变小的幅度与DPPH·被清除的程度呈线形关系，故可用于检测自由基被清除的程度。

根据文献［10］略做修改。在2 mL不同浓度的样液中加入2 mL DPPH溶液(0.08 mol/L)，摇匀，静置30 min，对照用80%的乙醇溶液代替样品，空白管为样品加70%的乙醇(DPPH的溶剂)。517 nm处测OD值。DPPH·清除能力(W)计算:

式中:A0为对照吸光度值;A1为样品吸光度值;A2为空白吸光度值。

样品的EC50值根据其517 nm下的样品曲线计算，BHT用作标准。

1.6.2 还原力［11］

当溶液中存在还原剂时，Fe3+和铁氰化物复合物会接受还原剂给出的电子转化为Fe2+形式的化合物，进而两者反应生成普鲁士蓝(Fe4［Fe(CN)6］3)，其在700 nm处有最强吸收峰，溶液颜色会由黄色变成不同程度的绿色－蓝色，故测定700 nm处的OD值即可测定Fe2+浓度。OD值越大，还原力越强。

根据文献［11］测定。在1 mL不同浓度的样液中分别依次加入2.5 mL磷酸缓冲液(50 mmol/L，pH 7.0)和 2.5 mL铁氰化钾溶液(1%)，50 ℃保温 20 min，然后迅速冷却，加入 2.5 mL三氯乙酸溶液(10%)，离心，取上清液。1.25 mL上清液中依次加入1.25 mL 蒸馏水和0.25 mL 氯化铁溶液(0.1%)，混合均匀，静置10 min，700 nm处测OD值。

样品的EC50值根据其700 nm下的样品曲线计算，BHT用作标准。

1.6.3 Fe2+螯合能力［12］

根据文献［12］所报道的方法进行了部分修改。在1.6 mL不同浓度的样液中分别依次加入1.6 mL蒸馏水、0.4 mL FeCl2(0.5 mmol)、0.4 mL 菲洛嗪(0.5 mmol/L)，然后剧烈摇动1 min，室温放置20 min后，562 nm处测OD值。空白管(A0)用蒸馏水代替样液。Fe2+螯合能力(M)计算:

式中:A1为样品吸光度值;A0为空白吸光度值。

样品的EC50值根据其562 nm下的样品曲线计算，EDTA用作标准。

1.6.4 O2－·的清除能力［13］

核黄素－蛋氨酸溶液被光照激发后，核黄素会与O2反应生成O－2·。此时，生成的自由基会将NBT还原为甲月朁(CN4H4)，呈蓝色，在560 nm处有特征吸收峰。当往溶液中加入超氧阴离子自由基清除剂时，其OD值会降低。因此比较加入提取液前后的OD值的变化，可以判断提取液对超氧阴离子自由基的清除能力。

根据文献［13］方法略做修改。1 mL磷酸缓冲液(50 mmol/L，pH 7.8)中分别依次加入 0.3 mL 甲硫氨酸溶液(130 mmol/L)、0.3 mL氯化硝基四氮唑蓝(NBT，750 μmmol/L)、0.3 mL EDTA－Na2(100 μmol/L)、0.3 mL 核黄素溶液(20 μmol/L)，混匀后加入 2 mL不同浓度的样液。在3 000 lX光照下放置20 min后，320 nm处测OD值。O－2·清除能力(C)计算:

其中:“A样品”是指不同浓度样品的吸光度，“A对照”是指对照的吸光度样品的EC50根据抗氧化剂活性比例和样品浓度图来计算。

1.7 菌丝球多糖的提取

准确称取3 g干燥后的菌丝体，置于研钵中研磨，转移至锥形瓶中，加入60 mL NaOH(1 mol/L)，80 ℃ 水浴4.5 h，5 000 r/min 离心 10 min，取上清液，以相同的方法对残渣进行复提。合并2次滤液，70℃旋转浓缩，得浓缩液。向浓缩液中加入3倍体积的95%乙醇，静置6 h，5 000 r/min离心10 min，取沉淀，将沉淀用蒸馏水定容至50 mL，备用。

1.8 多糖含量的测定

1.8.1 总糖含量的测定

采用苯酚－硫酸法［14］。将定容至50 mL的样品液稀释50倍，吸取1 mL，然后加入1 mL蒸馏水，1 mL苯酚(6.0%)及5 mL 浓 H2SO4，静置 10 min，摇匀，室温下放置20 min，490 nm处测OD值。空白对照用蒸馏水代替样品液。

1.8.2 还原糖含量的测定

采用 3，5－二硝基水杨酸法［15］。吸取定容至 50 mL的样品液各2 mL，加入1 mL蒸馏水，3 mL DNS，加热并煮沸7 min，迅速用流水冷却至室温，550 nm处测OD值。空白对照用蒸馏水代替样品液。

1.8.3 多糖含量的计算

多糖含量/%=总糖含量/%－还原糖含量/%

1.9 统计学分析

实验设3次重复，实验结果用SPSS软件(版本18.0)Duncan多重比较法［16］进行多个均数间的两两比较和T检验。

2 结果与分析

2.1 DPPH·清除能力的比较

从图1可以看出，当巴西蘑菇与双孢蘑菇菌丝球提取液的浓度从3 mg/mL提高到15 mg/mL时，二者的DPPH·清除能力也逐渐增强。当浓度为3 mg/mL和6 mg/mL时双孢蘑菇菌丝球提取液的DPPH·清除能力要高于巴西蘑菇，且差异显著;当提取液浓度为9、12、15 mg/mL时，双孢蘑菇菌丝球提取液的清除能力仍高于巴西蘑菇，但差异不显著，而且随着浓度的升高，两者差异逐渐变小;当提取液浓度为15 mg/mL时，双孢蘑菇对DPPH·的清除率为88.4%，巴西蘑菇为86.97%。

图1 巴西蘑菇与双孢蘑菇菌丝球提取液的DPPH·清除能力Fig.1 Scavenging effect on DPPH radical of Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

2.2 还原力的比较

由图2可以看出，当菌丝球提取液的浓度从3 mg/mL提高到15 mg/mL时，二者的还原力均逐渐增强，且巴西蘑菇的还原力高于双孢蘑菇。当浓度较低时，两种菌的还原力差异不显著，当浓度增加到15 mg/mL时，两种菌的还原力有显著性差异。

2.3 Fe2+螯合能力的比较

从图3可以看出，当菌丝球提取液浓度从3 mg/mL提高到15 mg/mL时，巴西蘑菇与双孢蘑菇菌丝球提取液的Fe2+螯合能力均逐渐增强，巴西蘑菇菌丝球提取液在各个浓度下的Fe2+螯合能力分别是双孢蘑菇的 5.18、2.01、1.79、1.35、1.28 倍。当浓度为 15 mg/mL时，巴西蘑菇菌丝球提取液的Fe2+螯合能力可达到86.38%，而双孢蘑菇仅为66.56%。由此可得，巴西蘑菇菌丝球提取液的Fe2+螯合能力高于双孢蘑菇，且差异极显著。

图2 巴西蘑菇与双孢蘑菇菌丝球提取液的还原力Fig.2 Reducing power of Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

图3 巴西蘑菇与双孢蘑菇菌丝球提取液的Fe2+螯合能力Fig.3 Ferrous Ions’chelating capacity of Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

2.4 O－2·清除能力的比较

从图4可知，当菌丝球提取液浓度从3 mg/mL提高到15 mg/mL时，巴西蘑菇与双孢蘑菇的O－2·清除能力均逐渐增强;当浓度较低时，巴西蘑菇菌丝球提取液的O－2·清除能力要显著高于双孢蘑菇，当浓度增大至15 mg/mL时，两种菌差异不显著。由此可得，两种菌对超氧阴离子均有一定的清除能力，而且巴西蘑菇菌丝球提取液的O－2·清除能力要高于双孢蘑菇。

2.5 抗氧化性各指标EC50值的比较

由表1可以看出，对于还原力，巴西蘑菇的EC50值远低于双孢蘑菇的(仅为其36.8%);对于Fe2+螯合能力，巴西蘑菇的EC50值也明显低于双孢蘑菇，其EC50值为双孢蘑菇的46.5%;对于O－2·的清除能力，巴西蘑菇的EC50值略低于双孢蘑菇，其EC50值为双孢蘑菇的86.0%;而对于DPPH·的清除能力，巴西蘑菇的EC50值则高于双孢蘑菇(其EC50值为双孢蘑菇的1.6倍)。经T检验，巴西蘑菇与双孢蘑菇菌丝球提取液各抗氧化活性指标的EC50值差异显著。综上所述，巴西蘑菇菌丝球提取液的抗氧化活性要明显高于双孢蘑菇菌丝球提取液的抗氧化活性。

图4 巴西蘑菇与双孢蘑菇菌丝球提取液清除能力的比较Fig.4 Superoxide anion’s scavenging capacity of Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

表1 巴西蘑菇与双孢蘑菇菌丝球抗氧化活性各指标EC50值的比较Table 1 Comparison of EC50index of antioxidant activity between Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

2.6 多糖含量的比较

由表2可以看出，巴西蘑菇与双孢蘑菇菌丝球的多糖含量差异显著，巴西蘑菇菌丝球的多糖含量达到9.85%，而双孢蘑菇菌丝球的多糖含量为8.42%。巴西蘑菇菌丝球的多糖含量要比双孢蘑菇高16.98%。

表2 巴西蘑菇与双孢蘑菇菌丝球多糖含量的比较Table 2 Comparison of polysaccharides content between Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

3 讨论

结果表明，巴西蘑菇和双孢蘑菇菌丝球提取液均具有一定的抗氧化活性，且巴西蘑菇的抗氧化活性和多糖含量均明显要高于双孢蘑菇。

目前，对食用菌多糖的研究主要集中在其子实体上，研究表明:香菇子实体为3.53%，大杯伞(Clitocybe maxima)子实体为0.23%，金针菇(Flammulina velutiper)子实体为1.65%，茶树菇(Agrocybe aegirit)子实体为0.92%，鸡腿菇(Copyinds comatus)子实体为2.28%［17］，巴西蘑菇子实体多糖含量为 6.34%［18］，双孢蘑菇多糖含量为3.38%［19］，而对于菌丝体多糖的研究较少。本实验结果表明:巴西蘑菇和双孢蘑菇菌丝体的多糖含量分别为9.85%和8.42%，均高于文献报道的巴西蘑菇和双孢蘑菇子实体的多糖含量。巴西蘑菇与双孢蘑菇菌丝体的多糖含量也比香菇、大杯伞、金针菇、茶树菇和鸡腿菇等子实体的多糖含量高。这从一个角度证明了巴西蘑菇和双孢蘑菇菌丝体具有很好的开发利用价值。有文献报道表明采用不同的多糖提取工艺，多糖的提取率会有较大的差异，如平菇破碎法提取多糖得率为11.20%，超声法提取多糖得率为9.75%，超声辅助复合酶法提取多糖得率为12.05%［20］，水提法多糖得率为6.48%［21］，说明提取工艺对多糖得率以及多糖含量的测定结果有较大的影响。本实验只用一种方法对巴西蘑菇和双孢蘑菇菌丝体的多糖进行了提取，下一步有必要借鉴对子实体的处理方式尝试采用其他方法进行多糖提取，或许能进一步提高两种菌丝体的多糖得率。

对于食用菌抗氧化活性的研究主要集中在子实体及其多糖抗氧化活性上。巴西蘑菇子实体的DPPH·清除能力的EC50值为2.378 mg/mL，还原力的EC50值为2.269 mg/mL，Fe2+螯合能力的 EC50值为2.788 mg/mL［22］，这些数据表明巴西蘑菇子实体的抗氧化性明显高于巴西蘑菇菌丝体的抗氧化活性。一般来说，食用菌子实体或菌丝体所含的多糖也有较高的抗氧化活性［23－24］，也就是说食用菌子实体或菌丝体的抗氧化活性会受到多糖含量的影响。对于食用菌子实体来说，一般含有较多的活性肽、核苷酸、黄酮类、萜类物质，而这些物质具有较强的抗氧化活性［25］，这些物质也必然会影响到子实体的抗氧化活性。所以，如果要彻底阐明巴西蘑菇子实体的抗氧化活性比菌丝体的抗氧化活性更强的原因，有必要对巴西蘑菇菌丝体的活性肽、核苷酸、黄酮类及萜类等物质进行深入分析。

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