心脑欣胶囊对慢性抑郁大鼠的作用研究

杨水金 ，于海洋 ，陈文娇 ，张国清 ，邹存生 ，马俊仓，吴留强，夏 彬，马世平*

1中国药科大学中药药理学教研室，南京 211198；2三普药业股份有限公司，西宁 214257

随着人们生活工作节奏的加快，抑郁症的发病率日趋增加。有学者预计本病将成为21世纪继心血管疾病之后的第二大危害人类健康的疾病[1]。抗抑郁药应用于临床已经有数十年，但由于抑郁症的发病机制较复杂，针对某单一环节的药物往往难以取得满意疗效。合成抗抑郁药大多存在抗抑郁谱窄、副作用大和易复发等缺陷。因此，国内外在抗抑郁药的研制与开发方面越来越注重传统药，尤其是有两千多年历史的中草药。

心脑欣胶囊是以藏药红景天为主要原料，辅以沙棘、枸杞提取物而制成的复方制剂，具有益气养阴、活血化痰的作用。临床报道心脑欣胶囊能减轻氟西汀的不良反应，提高高原地区老年抑郁症患者对抗抑郁药的耐受性、依从性，治疗效果好、不良反应少，是适合治疗高原地区老年抑郁症的理想药物[2]。红景天为该方君药，具有补气清肺、益智养心、收涩止血、散瘀消肿之功效。现代药理研究显示其具有抗缺氧，抗疲劳，延缓衰老，对中枢神经及内分泌系统的双向调节等多种活性，临床应用于提高大脑功能、神经官能症、张力减退综合征和高原反应等病症[3-4]。本实验研究心脑欣胶囊对慢性不可预知应激抑郁模型大鼠的抗抑郁作用，并探讨其作用机制。

1 材 料

1.1 药物和试剂

心脑欣胶囊，内容物为棕褐色粉末，0.5 g/粒，批号：120803，三普药业股份有限公司产品；实验时，去除胶囊外壳，研磨内容物，用双蒸水配置成所需浓度。盐酸氟西汀片，批号：BJ09103，常州四药制药有限公司产品；实验时，研磨为粉末，用双蒸水配置成所需浓度。

NO（批号 20130426）、iNOS（批号 20130529）、MAO测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；二氯甲烷、浓硫酸、无水乙醇均为化学纯；硫酸乙醇呈色液:量取7份分析纯浓硫酸和3份分析纯无水乙醇混合；0.04 mol·L-1NaOH 溶液。

1.2 动物

清洁级SD大鼠，雄性，体重180～220 g，由扬州大学比较医学中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2012-0004。动物分笼饲养，保持12 h昼夜节律，室温22±1℃，自由饮水摄食。

2 方法与结果

2.1 动物造模、分组及给药

雄性SD大鼠，适应性饲养1周后，按体重随机分为6组，每组10只，分别为空白组（给予蒸馏水），模型组（给予蒸馏水），盐酸氟西汀组（10 mg·kg-1）和心脑欣胶囊低（100 mg·kg-1）、中（200 mg·kg-1）、高（400 mg·kg-1）剂量组。除空白组大鼠，每天灌胃给予蒸馏水，不接受任何刺激外，其余各组大鼠每天随机给予不同刺激。应激方式包括：冷水游泳（10°C，6 min）、昼夜颠倒（24 h）、接触异物（24 h）、禁食（24 h）、禁水（24 h）、水平摇晃（1 次/s，10 min）、噪音（10 min）和 45°倾斜鼠笼（24 h）共 8种刺激方式，每天随机安排1～2种刺激，平均每种刺激各3次。连续造模和给药21 d，各组每日上午9时灌胃，每日一次，给药体积均为0.1 mL/10 g。

2.2 开野实验

各组大鼠于末次给药后1 h用1.22 m2×45 cm高的敞箱（4×4方格）测定各组大鼠6 min行为学的改变。比较正常大鼠、慢性应激大鼠和给予心脑欣胶囊和盐酸氟西汀的大鼠在后3 min内自发活动的差异，观察指标包括：（1）水平穿格次数（行走路线与格子交叉点数）；（2）直立次数（大鼠两前爪腾空或攀附箱壁次数）。行为评定采用单盲法，观察慢性应激及药物对大鼠自发活动能力的影响。

结果显示，与空白组大鼠比较，模型组大鼠自发活动能力明显降低，表现为穿格次数、直立次数明显减少；给予心脑欣胶囊后，与模型组相比，大鼠的穿格次数、直立次数明显增加；盐酸氟西汀组组表现出相同的作用。结果见表1。

表1 心脑欣胶囊对慢性抑郁模型大鼠糖水偏好率、强迫游泳和悬尾不动时间、开野实验的影响（±s，n=10）

表1 心脑欣胶囊对慢性抑郁模型大鼠糖水偏好率、强迫游泳和悬尾不动时间、开野实验的影响（±s，n=10）

注：与空白组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

组别 剂量（mg·kg-1） 糖水偏好率（%） 游泳不动时间（s） 悬尾不动时间（s） 开野实验穿格次数 直立次数空白组模型组氟西汀组心脑欣胶囊组心脑欣胶囊组心脑欣胶囊组——1 0 100 200 400 89.41±8.89 49.60±10.37△△92.10±2.60**88.28±13.93**82.71±18.05**89.35±6.13**62.5±20.60 91.40±21.18△△38.38±11.33**56.70±15.20*48.40±13.30*48.00±13.70*90.00±21.40 159.00±24.10△△50.50±17.81*156.33±12.10 149.43±28.57 129.30±16.09*35.33±11.92 4.67±1.75△△21.75±5.31**20.80±6.49**19.29±7.29*21.00±5.93**8.50±3.33 1.50±1.22△△4.67±1.63**5.83±1.60*7.17±2.56**10.25±2.36**

2.3 糖水消耗实验

各组大鼠于末次给药后1 h分别测定各组大鼠的糖水消耗量（sucrose intake）。参照文献方法[5-6]，每笼同时放置2个水瓶，第1个24 h 2瓶均装有1%（w/v）蔗糖水，随后 24 h，1 瓶 1%蔗糖水，1 瓶纯水。之后禁食禁水12 h后大鼠单独饲养，给予1瓶1%蔗糖水、1瓶纯水，测定12 h（中途6 h时交换瓶子位置）各组大鼠的糖水、纯水以及总液体的消耗量。比较各组大鼠在糖水消耗及糖水偏好方面的差异。糖水偏好（sucrose preference，SP）以蔗糖水溶液的消耗量（g）/总液体的消耗量（g）×100%表示。

结果显示，与空白组大鼠比较，模型组大鼠糖水偏好明显降低（△△P＜0.01），出现快感缺乏症状；与模型组相比，给予心脑欣胶囊后可显著增加大鼠糖水偏好；盐酸氟西汀组表现出相同的作用。表明心脑欣胶囊可改善慢性抑郁大鼠的情绪，结果见表1。

2.4 悬尾实验

各组大鼠于末次给药后1 h进行悬尾实验。参照Steru等[8]的方法，将大鼠尾端4 cm的部位贴在一根水平木棍上，使动物成倒挂状态，其头部离台面约15 cm，用板隔开相邻动物的视线。判断标准：大鼠被动悬挂期间，无任何活动时，定为不动状态。观察6 min，比较各组大鼠在后4 min内累计不动时间。

结果显示，与空白组大鼠比较，模型组大鼠悬尾不动时间明显增加（△△P＜0.01）；与模型组相比，心脑欣胶囊高剂量组可显著降低大鼠悬尾不动时间（*P＜0.05）； 盐酸氟西汀组表现出相同的作用 （△P＜0.05）。结果见表1。

2.5 强迫游泳实验

各组大鼠于末次给药后1 h进行强迫游泳实验。参照Porsolt等[7]方法，将大鼠置于水深30 cm、水温25°C的玻璃圆筒（50 cm高，25 cm直径）中，观察6 min，比较各组大鼠在后4 min内的累计不动时间。不动时间判定：大鼠漂浮在水面，不努力爬出圆筒，仅做一些必须保持其头部在水面的动作。

结果显示，与空白组大鼠比较，模型组大鼠强迫游泳不动时间明显增加（△△P＜0.01）；与模型组相比，盐酸氟西汀组与心脑欣各剂量组均可显著降低大鼠强迫游泳不动时间，结果见表1。

2.6 大鼠血清皮质酮含量的测定

大鼠强迫游泳实验结束后1 h，股动脉取血处死，分离血清。采用荧光法测定，参照Frankel等[9]的方法取0.50 mL， 加入0.50 mL 0.04 mol·L-1NaOH溶液，充分混匀后置60 mL分液漏斗中，加5 mL二氯甲烷充分振荡2 min，静置分层后，弃水相，用10 mL试管收集二氯甲烷，加入2.5 mL硫酸乙醇（7∶3）呈色液，充分摇匀2 min后静置30 min，小心用细头吸管将二氯甲烷层吸去，呈色液静置30 min后在荧光分光光度计上，激发波长470 nm、发射波长525 nm（激发波长狭缝10 nm，发射波长狭缝20 nm）处测定荧光值。

结果显示，与空白组大鼠比较，模型组大鼠血清皮质酮含量明显增加（△△P＜0.01）；与模型组相比，心脑欣胶囊中低剂量组可显著降低大鼠血清皮质酮含量（*P＜0.05）；盐酸氟西汀组表现出相同的作用（△△P＜0.01）。 结果见表 2。 皮质酮的标准曲线为：Y=0.328X+0.0038，r2=0.997

表2 心脑欣胶囊对慢性抑郁模型大鼠海马MAO、iNOS、NO含量及血清皮质酮含量的影响（±s，n=10）

表2 心脑欣胶囊对慢性抑郁模型大鼠海马MAO、iNOS、NO含量及血清皮质酮含量的影响（±s，n=10）

注：与空白组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

组别空白组模型组氟西汀组心脑欣胶囊组心脑欣胶囊组心脑欣胶囊组剂量（mg·kg-1）——1 0 100 200 400 MAO（U·mgprot-1）4.90±0.24 7.94±0.57△△4.64±0.17**4.48±0.36**4.67±0.37**3.65±0.28**iNOS（U·mgprot-1）0.73±0.19 1.4±0.56△0.77±0.19*0.88±0.28**0.92±0.20**1.03±0.43*NO（μmol·gprot-1）2.48±0.45 7.86±0.68△△2.33±0.26**3.65±0.26**2.78±0.27**2.65±0.34*皮质酮（μg·mL-1）0.29±0.09 0.67±0.07△△0.34±0.08**0.61±0.12*0.59±0.10*0.64±0.11

2.7 大鼠海马组织MAO活力测定

大鼠强迫游泳实验结束后1 h处死，冰台上迅速分离海马，准确称得重量，按重量体积比加入生理盐水制成10%的组织匀浆，3000 r·min-1离心10 min，取组织匀浆上清液进行测定。按照MAO试剂盒说明书进行操作；BCA测定法测定组织中的蛋白含量。

结果显示，与空白组大鼠比较，模型组大鼠脑组织 MAO 活力明显升高（△△P＜0.01）；与模型组相比，盐酸氟西汀组与心脑欣胶囊各剂量组均可显著降低大鼠脑组织MAO的活力。结果见表2。

2.8 大鼠海马组织iNOS测定

取脑，冰台上迅速分离双侧海马，准确称得重量，冰浴中按重量体积比加入生理盐水制成10%的组织匀浆，3000 r·min-1离心10 min，取组织匀浆上清液进行测定。按照iNOS试剂盒说明书操作，参考BCA测定法测定组织中的蛋白含量。

结果显示，与空白组大鼠比较，模型组大鼠脑组织iNOS活力明显升高 （△P＜0.05）；与模型组相比，心脑欣胶囊可显著降低大鼠脑组织iNOS的活力（*P＜0.05）。 结果见表 2。

2.9 大鼠海马组织NO含量的测定

取脑，冰台上迅速分离双侧海马组织，称重，冰浴中按重量体积比加入生理盐水制成10%的组织匀浆，3000 r·min-1离心10 min，取组织匀浆上清液进行测定。按照NO试剂盒说明书操作测定含量（硝酸还原酶法）。试剂配制按说明进行，取10%的匀浆液稀释9倍，配成1%的组织匀浆液。量取0.5 mL与试剂混匀，37℃水浴60 min，充分涡旋混匀30 s，室温静置 10 min，3000 r·min-1离心 10 min，取上清液。蒸馏水调零，紫外分光光度计测定各管吸光度值。

结果显示，与空白组大鼠比较，模型组大鼠脑组织NO含量明显升高（△△P＜0.01）；与模型组相比，心脑欣胶囊可显著降低大鼠脑组织NO含量 （**P＜0.01）。结果见表2。

2.10 统计学方法

3 讨 论

不可预知慢性应激抑郁模型，是将多种不同的应激因子依次随机在实验过程中应用，特点是应激因子的多变性和不可预测性，其模拟行为学以及神经内分泌等变化与人类抑郁症相类似，已成为国内外研究抑郁症的发病机制及抗抑郁药物作用机制而广泛应用的动物模型之一[10-11]。本实验参照文献方法，利用慢性不可预知中等强度应激刺激进行造模。结果显示，与空白组比较，模型组大鼠水平穿格次数、直立次数明显减少，糖水消耗量明显降低，强迫游泳和悬尾不动时间显著延长，表明该模型大鼠在行为学上表现为活动度、对新鲜周围环境的好奇度以及对奖赏反应均显著下降，表明不可预知慢性应激模型造模成功。而通过连续21 d给予心脑欣胶囊可显著逆转这一行为学异常改变，提示心脑欣胶囊具有较强的抗抑郁作用。

抑郁症的发生机制复杂，可能与慢性应激刺激导致的海马结构功能损伤有关，而下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴在机体的应激反应中发挥着重要作用。当机体受到刺激时，下丘脑室旁核（paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN）小细胞神经元分泌促肾上腺皮质激 素 释 放 激 素 （corticotropin releasing hormone，CRH），进而刺激垂体分泌促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH），ACTH 经血循环达肾上腺，促使应激激素糖皮质类固醇（glucocorticoid，GC）分泌增多，从而动员储能,适应应激反应，有利于机体度过短期恶劣环境。另外，海马富含糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR），且是中枢GR含量最多的脑区[12]，海马可通过GR抑制应激过程中激活的HPA轴，使之恢复到基础水平。但长期慢性应激刺激能够持续激活HPA轴，导致GC水平持续升高，过量GC极易造成富含GR的海马受损，从而减弱海马对HPA轴的抑制作用，进一步加重HPA轴的亢进。本实验中，经过21天不可预知的慢性应激，模型大鼠血清皮质酮含量显著升高，而心脑欣胶囊中、低剂量组可以显著降低应激大鼠血清皮质酮水平,提示心脑欣胶囊可以抑制应激过程HPA轴的过度激活，降低血清皮质酮含量。

也有研究表明，抑郁症的发生与活性氮自由基引起的神经元死亡密切相关。NO作为细胞内及细胞间非典型的神经信使，在中枢神经系统中起到双重作用，生理浓度的NO起到信号分子的作用，可导向轴突生长，参与突触重塑，起到调控、转导作用[13-14]；但高浓度NO则具有神经细胞毒性，引起细胞代谢及功能障碍，对细胞造成损伤，导致细胞死亡[15]。NO在体内由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸产生NO[16]。NOS包括三种同工酶，即诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、神经元性一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS），目前认为中枢神经系统过度表达iNOS是造成神经元损伤的重要原因[17-18]。有研究表明，由iNOS合成的过量的NO能升高caspase-3活性，促进细胞凋亡的发生；过量的NO也能通过改变线粒体结构和功能，干扰能量代谢诱导细胞凋亡；NO还能通过激活p53作用于Bax引起细胞凋亡[19]，而抑制iNOS的表达就能相应的减少凋亡的发生[20-21]。动物实验还证明，iNOS抑制剂L-硝基-精氨酸甲酯可减轻海马内注射N-methyl-D-aspartic acid（NMDA）引起的神经损害[22]，均提示NO对海马的毒性。本实验中，连续21天的慢性应激显著激活大鼠海马组织iNOS活性并增加NO的含量；而在慢性应激同时给予心脑欣胶囊大鼠的海马组织NO含量及iNOS活性明显降低。提示心脑欣胶囊可能通过抑制iNOS的活性，降低NO水平，抑制细胞凋亡而发挥抗抑郁作用。

此外，本实验研究还发现，心脑欣胶囊可显著降低应激大鼠海马组织中MAO的活性，提示心脑欣胶囊可能通过抑制MAO的活性进而提高中枢单胺类神经递质的含量发挥抗抑郁作用。

综上所述，心脑欣胶囊对慢性不可预知应激抑郁模型动物具有明显的抗抑郁作用,其机制可能与抑制MAO，iNOS活性，降低皮质酮和NO水平，减轻其对海马的损伤等多方面发挥抗抑郁作用。然而心脑欣胶囊对抑郁模型大鼠HPA轴其它方面的作用 （如下丘脑CRH浓度、CRH mRNA的表达）、脑内单胺递质的含量以及心脑欣胶囊发挥抗抑郁作用的物质基础等还有待于进一步研究。

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