贵州省首例空肠弯曲菌菌血症病例病原鉴定和亚种分型

韦小瑜，田克诚，游 旅，唐光鹏，王定明

Email：weixyuse＠foxmail.com

弯曲菌是重要的食源性人兽共患病原菌，可引起人类急性肠炎，并可并发格林巴利综合征、菌血症、活动性关节炎等多种疾病[1]。本文从1例新生儿剥脱性皮炎患者的血液中分离出疑似空肠弯曲菌，并进行形态学、系统生化和分子生物学鉴定。

1 材料与方法

1.1 病例 患者为出生11d的女婴，家住贵州省仁怀市九仓镇，家中生产。患儿出生8d时出现口周皮肤潮红，渐发展为全身皮肤潮红，面部、四肢、腹部皮肤部分剥脱等症状体征，遂入住遵义医学院附属医院新生儿科，诊断为“新生儿剥脱性皮炎，颅内感染？鹅口疮”。其住院期间最高体温40.6。C（肛温），伴四肢抽搐，反应差。实验室检查：WBC13.87×109／L，中性淋巴细胞比例56%，淋巴细胞比例31%，单核细胞比例12%；肝功能ALT54U／L，AST68U／L，总胆红素92.1umol／L，直接胆红素20umol／L，肌酸激酶359U／L，乳酸脱氢酶572U／L。该医院采用血培养法从患者血液中分离到病原菌，经细菌鉴定仪鉴定为“弗朗西斯菌”，并将菌株送至本室鉴定。

1.2 主要试剂和仪器 哥仑比亚血琼脂基础购自英国OXOID公司，脱纤维羊血购自北京友康基业公司，细菌基因组提取试剂盒购自大连宝生物公司。微需氧培养箱为CB150（Binder，德国）；PCR 仪为德国80W－Tprofessional Gradient 96；凝胶成像仪为Gel Doc2000型（Bio－Rad，美国）；全自动微生物鉴定仪为VITEK2.0（法国，梅里埃）。引物合成由大连宝生物公司完成。

1.3 试验菌和参考菌株 试验菌株分离自“新生儿剥脱性皮炎”患者血液的“弗朗西斯菌“疑似菌株，编号：GZ201201，参考菌株由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供（CJ参考株）。

1.4 传统细菌学方法鉴定空肠弯曲菌 按照 WS271－2007标准进行，试验内容包括菌落培养条件、观察菌落生长时间、形态、菌落染色、氧化酶和触酶试验等。

1.5 系统生化鉴定空肠弯曲菌 采用梅里埃VITEK2.0全自动微生物鉴定仪，将试验菌和空肠弯曲菌参考菌株制成菌悬液后，上NH卡进行微生物系统生化鉴定。

1.6 DNA提取 将试验菌和参考菌株接种至哥仑比亚血平板培养48h后，使用细菌基因组提取试剂盒按照说明书操作步骤提取细菌DNA。

1.7 多重PCR方法鉴定空肠弯曲菌 按照文献[2]提供的16sRNA、mapA引物序列和参数对试验菌和参考菌株核酸进行扩增，以参考菌株核酸作为阳性对照，超纯水作为阴性对照。

1.8 NAP－mPCR方法鉴定空肠弯曲菌亚种 采用文献[3]所述NAP－mPCR引物序列和参数对试验菌和参考菌株进行空肠弯曲菌亚种的鉴定，引物序列见表1。

表1 NAP－mPCR用引物Tab.1 Primers used in NAP－mPCR

2 结 果

2.1 试验菌形态、染色及常规生化鉴定结果 试验菌转种至哥仑比亚选择性血平板，37。C普通培养箱培养48h后未见菌落生长，42。C微需氧培养箱（85%N2，10%CO2，5%O2）培养48h后，可见大小约0.5～1mm、圆形、边缘整齐、无色透明、水滴状、表面光滑湿润、不溶血的菌落；挑选典型菌落进行革兰染色镜检，菌体形态为革兰染色阴性、呈S形或海鸥展翅状、无芽孢的细长弯曲菌；试验菌触酶、氧化酶和马脲酸盐水解试验均为阳性。符合空肠弯曲菌的生长条件、菌落形态和基础生化特征。

2.2 系统生化鉴定结果 将试验菌和空肠弯曲菌参考菌株进行全自动微生物系统生化鉴定，结果显示两种菌均为空肠弯曲菌空肠亚种，鉴定度为99%，见表2。

表2 疑似空肠弯曲菌菌株的系统生化鉴定结果Tab.2 Identification on suspicious strain of Campylobacter jejuni by VITEK biochemical methods

2.3 多重PCR方法鉴定结果 采用特异性种属多重PCR方法对试验菌株和参考菌株核酸进行扩增，结果显示两种菌均获得857bp（16sRNA）及589bp（mapA）两条特异性扩增片断，而阴性对照无条带扩增。

2.4 NAP－mPCR 方法鉴定结果采用 NAP－mPCR方法对试验菌和参考菌株核酸进行检测，结果显示两种菌均获得1 454bp和1 016bp的两条特异性条带，而阴性对照无条带出现（图1）。

3 讨 论

空肠弯曲菌是引起世界食源性疾病的常见病原菌，常引起肠道感染，每1 000个肠道感染的病例就有1.5个会发展为菌血症或败血症，而且0.1%的弯曲菌感染病例，尤其空肠弯曲感染会发展为格林巴利综合征[4]。空肠弯曲菌分为两个亚种：空肠亚种和德莱亚种。本试验研究证实从贵州省1例菌血症患儿的血液中分离到空肠弯曲菌，经传统细菌学方法、特异性种属mPCR方法和NAP－mPCR方法鉴定为空肠弯曲菌空肠亚种。

图1 血培养空肠弯曲菌分离株NAP－mPCR结果Fig.1 NAP－mPCR results of the Campylobacter jejuni strain from blood culture

本实验通过观察菌落生长条件和菌落形态、菌落染色、氧化酶、触酶试验及系统生化鉴定将试验菌鉴定为空肠弯曲菌空肠亚种，提示传统的表型分型仍然可作为空肠弯曲菌分型的手段，但传统的表型分型实验过程需要的菌量较大，耗时较长，且会出现错误的判断结果[3]。而PCR方法仅需单个菌落提取核酸进行反应，实验时间短，特异性强，优于传统表型分型方法。本研究中采用基于16sRNA、mapA两个基因的多重PCR技术将菌血症患者血培养分离菌株鉴定为空肠弯曲菌，该方法亦曾在贵州省腹泻病例空肠弯曲菌的鉴定中得到应用[5]。

空肠弯曲菌亚种的表型鉴定主要通过硝酸盐还原试验来判断，但该方法耗时长需1～2d，所需菌量大，而且会出现错误结果，Miller[3]以硝酸盐还原酶（nitrate reductase，nap）位点为基础设计的多重PCR（NAP－mPCR）检测方法，对分离自临床病例、动物和环境的158株空肠弯曲菌空肠亚种和20株空肠弯曲菌德莱亚种研究结果显示，该方法可对空肠弯曲菌空肠亚种（1 454bp，1 016bp）和德莱亚种（973bp或494bp）进行100%的分型鉴定。本实验中GZ201201和CJ参考株经NAP－mPCR方法检测鉴定为空肠弯曲菌空肠亚种，与系统生化检测结果完全一致。

最初，本菌株被医院实验室鉴定为“弗朗西斯菌”，与最终鉴定结果不符。因空肠弯曲菌培养条件苛刻，其在不同的培养条件下生长速度、形态大小及菌落革兰染色形态均有不同，在不利于其生长的条件下生长速度缓慢，菌落小，革兰染色出现菌体球形变化，仅少许呈弯曲状，因此导致进行系统生化鉴定时可能会出现选卡错误而识别为其他菌。

弯曲菌是引起儿童肠炎的常见病原菌，其菌血症的发生常发生于免疫缺陷的儿童[6]。本例空肠弯曲菌空肠亚种菌血症患者为新生儿，免疫力低下，大片皮肤剥脱，皮肤屏障破坏，全身皮肤感染重，致使病原菌侵入血液引起菌血症。贵州省1988年和2010年均在腹泻病例的病原监测中检出空肠弯曲菌[7－8]。

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