梅州地区临床分离耐碳氢霉烯类鲍曼不动杆菌的耐药机制及分子流行病学研究

肖光文，汪雪涛，乔亚峰，邹尚平，叶振东

2.临澧县人民医院检验科，常德 415200；

3.梅州市人民医院检验科，梅州 514031；

Email：270591805＠qq.com

随着抗菌药物使用而出现的细菌耐药性问题越来越严重，NDM－1超级细菌[1]越来越受到医学界的关注。鲍曼不动杆菌作为构成超级细菌的重要细菌之一，对其耐药问题的研究越来越被临床所重视。亚胺培南、美罗培南等碳氢霉烯类抗菌药物是临床治疗多重耐药鲍曼不动杆菌感染疗效最好的药物之一。随着该类药物在临床上的广泛运用，近年来耐药率有升高的趋势。鉴于目前鲍曼不动杆菌的耐药现状，对梅州地区临床分离的耐碳氢霉烯类鲍曼不动 杆 菌 （Carbapenem－resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB）的耐药情况及耐药机制进行研究。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 2012年1－12月从梅州地区1家三级医院，4家二级医院门诊和住院病人的各类临床标本中分离无重复的鲍曼不动杆菌703株，其中CRAB 210株。

1.2 质控菌株 大肠埃希氏菌（ATCC25922），铜绿假单胞菌（ATCC27853）。

1.3 主要仪器与试剂 基因扩增仪、电泳仪为美国Bio－rad公司产品；凝胶成像系统为法国VL公司产品；药敏试验用药敏纸片为英国Oxoid公司产品，MH培养基为杭州天和公司提供。DNA分子标准、PremiX Taq酶等PCR试剂购自日本TaKaPa公司。引物设计由上海生工生物技术有限公司合成，序列分析由北京诺赛基因组研究中心完成。

1.4 药敏试验 按临床微生物学操作规程对标本进行接种培养后，药敏试验采用纸片扩散法进行，部分医院采用自动化仪器进行。实验结果严格按照2010年版美国临床实验室标准化协会（CLSI）判断标准执行。

1.5 耐碳氢霉烯表型的筛选 用改良的Hodge试验检测碳氢霉烯酶，根据文献[2]按照CLSI推荐方法进行。将浓度为1.5×108CFU／mL的大肠埃希菌ATCC25922按照10倍稀释后涂布于M－H平板，中央贴上亚胺培南（10μg）药敏纸片，接种环调取待检菌自纸片外缘向平板边缘划线接种，过程中注意勿划破平板。35。C培养18h，亚胺培南抑菌圈处出现矢状生长现象的为产碳氢霉烯酶菌株。

1.6 用PCR法分析主要碳氢霉烯酶基因 煮沸法提取细菌DNA：将培养18h的待检菌单个菌落于500μL TE buffer中，沸水浴10min，10 000r／min离心5min，取2μL上清作DNA模板。PCR扩增反应体系为：反应体系共50μL，其中每条引物1 μL，MgCl25μL，dNTP 4μL，Tag酶0.5μL，模板2 μL，H2O 37μL。反应条件为：94。C预变性5min；94。C变性1min，55。C退火1min，72。C延伸1min，30个循环；72。C延伸10min。检测不同类型的碳氢霉烯基因的反应条件可能不同，以文献报道为参考。所用引物见表1。PCR产物在含有EB为1.5%的琼脂糖凝胶上100V恒压电泳50min后，用凝胶成像系统进行观察并拍照。PCR产物经测序后在GenBank进行同源查询工具分析。

表1 碳氢霉烯酶基因PCR引物序列及扩增片段长度Tab.1 Primer sequences for PCR and expected product size of carbapenemase

1.7 采用重复序列聚合酶链反应（ERIC－PCR）分析同源性 引物设计为 ERIC－F，5′－3′：ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC，ERIC－R，5′ － 3′：AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。ERIC－PCR体系的组成和反应条件：总反应体系为50μL，dNTP 4μL，模板DNA 2μL，Tap酶0.25μL，10×缓冲液 5μL，ERIC－F 1μL，ERIC－R 1μL，H2O 36.75μL；预变性95。C5min，循环变性95。C45s，退火42。C30s，延伸72。C1min，40个循环后，72。C延伸10min。取5μL产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，观察结果并判断同源性。

2 结 果

2.1 药物敏感性试验结果210株CRAB对抗菌药物的药敏结果见表2。

表2 210株CRAB对抗菌药物的敏感率（%）Tab.2 Drug susceptibility rates of 210strains of CRAB（%）

2.2 碳氢霉烯酶表型筛选结果 在CRAB的210菌株中，采用改良Hodge试验得到阳性菌株163株（77.62%），阴性菌株47株（22.38%）。在163株阳性菌株中，同时对美罗培南和亚胺培南耐药的为158株，仅对美罗培南耐药的为2株，仅对亚胺培南耐药的为3株。

图1 CRAB的改良Hodge试验结果Fig.1 Results of modified Hodge test of CRAB

2.3 用PCR法分析主要碳氢霉烯基因结果 210个菌株中，Bla－OXA－51的检出率为最高为94.29%（198／210），其中碳氢霉烯酶表型阳性163株菌株全部检出Bla－OXA－51。Bla－OXA－23的检出率次之为78.57%（165／210），其中碳氢霉烯酶表型阳性菌株有158株检出 Bla－OXA－23，另外7株 Bla－OXA－23检出菌株为表型阴性。Bla－VIM的检出率为4.29%（9／210），全部为碳氢霉烯酶表型阳性。Bla－IMP、Bla－OXA－24、Bla－OXA－58均未被检出。BLAST 分析结果显示：Bla－OXA－23扩增产物经DNA测序表面序列长度为502bp，经比对其序列符合率为99.9%；Bla－VIM扩增产物经DNA测序表面序列长度为756bp，经比对其序列符合率为99.6%；Bla－OXA－51扩增产物经DNA测序表面序列长度为359bp，经比对其序列符合率为99.8%。（见图2）

图2 部分 Bla－OXA－23、Bla－VIM、Bla－OXA－51PCR 扩增结果Fig.2 Representative PCR electropherogram of Bla－OXA－23，Bla－VIM and Bla－OXA－51

2.4 ERIC－PCR分析同源性结果 210株CRAB ERIC－PCR分型结果显示，主要有7个型别，其中A型97株，A1型53株，A2型44株；B型44株，B1型40株，B2型20株；其他为C型6株，D型7株，E型9株，F型6株，H型25株。（见图3）

图3 部分CRAB的ERIC－PCR结果Fig.3 ERIC－PCR result of parts of the CRAB

3 讨 论

近年来，随着碳青霉烯类抗生素在临床上的广泛运用，对其耐药的细菌越来越多，且往往对临床很多常用抗菌药物也耐药而成为泛耐药株，鲍曼不动杆菌就是这些细菌的典型代表之一。这种耐药往往导致临床患者住院时间的延长而加重患者的经济及心理负担，甚至严重的可引起患者的死亡[3]。本研究对梅州地区临床CRAB对常规药物的研究表明：CRAB对常规药物除多粘菌素B外，对其他的抗菌药物的耐药率都在60%以上。其中对头孢哌酮／舒巴坦和多西环素的耐药率在60%左右外，其余14种耐药率都超过了80%，磺胺甲噁唑甚至是100%耐药。这比2010年中国CHINET对临床分离的鲍曼不动杆菌耐药性监测数据[4]明显增高。说明鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药容易出现多重耐药甚至泛耐药。近年来，多粘菌素B治疗多重耐药，特别是对鲍曼不动杆菌取得了较好的疗效，引起了临床的关注。本研究表明多粘菌素B对CRAB敏感率达到99.52%，可以作为本地区治疗CRAB的重要药物。

目前，多重耐药鲍曼不动杆菌主要的耐药机制有：产生碳氢霉烯酶，药物主要外排系统的过度表达，外膜孔蛋白的改变及与青霉素结合蛋白（PBPs）的亲和力下降等[5]。细菌耐药性的产生往往是一种或几种机制共同作用所致[6]，CRAB的耐药机制尤以质粒或染色体介导的各类碳氢霉烯酶明显重要。本研究中，163株（77.62%）的菌株采用改良的Hodge试验呈阳性结果，说明这些菌株可以产生碳氢霉烯酶。而47株（22.38%）呈现阴性，但基因检测有 检 出 Bla－OXA－51 及 Bla－OXA－23，提 示 改 良Hodge试验检测碳氢霉烯酶有漏检现象，这可能是不同菌株产生碳氢霉烯酶对碳青霉烯类抗生素水解能力的差异导致出现的矢状生长区域大小不同。这与雷红等[7]报道的改良Hodge试验（亚胺培南纸片法）阳性率为66.7%接近。

碳氢霉烯酶主要有A、B、D 3类β内酰胺酶，其中A和D类均为丝氨酸酶，前者主要存在于肠杆菌科细菌中，鲍曼不动杆菌主要见于后者。D类β内酰胺酶即OXA酶，可以灭活碳青霉烯类抗生素，不动杆菌中发现的主要有 OXA－21、OXA－23～OXA－27、OXA－40、OXA－58 等[8]，可 分 为 4 组，分 别 以OXA－23、OXA－24、OXA－51、OXA－58为代表。B类为金属β内酰胺酶目前检出率低于OXA酶，但对碳氢霉烯类抗生素的水解活性是其10～1 000倍[9]，主要有IMP型、VIM 型和SIM 型，不动杆菌中发现的主要为IMP型和VIM型。所以本研究选取了 OXA－23、OXA－24、OXA－51、OXA－58、IMP和VIM 6个基因进行检测。结果显示，Bla－OXA－51检出率最高为 94.29%，其次为 Bla－OXA－23 为78.57%，Bla－VIM 的 检 出 率 为 4.29%，Bla－IMP、Bla－OXA－24、Bla－OXA－58均未被检出。提示梅州地区鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药主要由OXA－51型和OXA－23型酶引起，这与国内梁伟[2]的报道是一致的，而低于孙立颖[10]的报道。Bla－VIM的检出率为4.29%，说明梅州地区2012年出现了产VIM型金属β内酰胺酶型鲍曼不动杆菌的感染，经追查为同一家医院的住院病人，据此我们可以推断有可能来自同一耐药菌株的克隆传播。

对耐药菌株进行基因同源性分析，从流行病学角度对有效抑制耐药菌株的扩散具有重要的意义。本研究对210株CRAB进行ERIC－PCR分型发现，主要有7种基因型，流行株以A型、B型和H型为主，其他型为散发流行。A型、B型一直是临床上比较常见的基因型[11]，在本地区各医院都有分布。对H型的追踪发现，主要出现在3～5月份一家医院的ICU 科，且全部为 Bla－OXA－51、Bla－OXA－23阳性，说明该院在3～5月ICU科暴发了H型株的流行。当发暴发流行后，立即启动了紧急措施进行了有效控制，随后几个月的监测表明该次暴发得到了有效的控制。

综上所述，梅州地区CRAB对临床常用抗菌药物的耐药现象比较严重，OXA型碳氢霉烯酶是本地区耐药的重要机制，并伴随也克隆株的流行。所以，对本地区医院CRAB监测，预防其暴发流行已经刻不容缓。

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