Th17细胞表达在丙种球蛋白耐药型川崎病发病机制中的作用研究

康辉+罗丽娟+蔡素芬+邹峥

[摘要] 目的 探讨Th17细胞在儿童丙种球蛋白耐药性川崎病发病机制中的作用。 方法 选择2013年5月～2014年5月本院诊断为川崎病的患儿100例作为研究对象，根据是否存在耐药性分为丙种球蛋白耐药组和非丙种球蛋白耐药组，选择30例正常儿童作为健康对照组，收集研究对象外周血4～5 ml，提取外周血单个核细胞，采用流式细胞术检测Th17细胞，采用荧光定量PCR检测IL-23P19与RORrt基因mRNA表达量。 结果 丙种球蛋白耐药组外周血PBMC中Th17细胞占CD4+细胞百分率明显高于非丙种球蛋白耐药组、健康对照组，且非丙种球蛋白耐药组高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；丙种球蛋白耐药组及非丙种球蛋白耐药组RORrt基因表达量高于健康对照组（P<0.05）；非丙种球蛋白耐药组IL-23P19基因mRNA表达量与健康对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 Th17细胞表达与丙种球蛋白耐药型川崎病发病具有相关性，这为丙种球蛋白耐药型川崎病的诊治及预后提供新的研究途径，有利于减少川崎病患儿心血管损伤的后遗症，保护儿童身心健康，具有较大的社会效益和经济效益。

[关键词] 辅助性T淋巴细胞17；丙种球蛋白耐药型川崎病；发病机制

[中图分类号] R54 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）10（a）-0024-03

川崎病是一种病因不明的以全身中、小血管炎为主要病变的儿童急性发热出疹性疾病，可导致冠状动脉损害[1]。大剂量丙种球蛋白联合阿司匹林是公认的有效方法，但仍有10%～20%患儿对丙种球蛋白耐药，其冠状动脉损害发生率达48.6%[2]。治疗前就可前瞻性地判断丙种球蛋白的有效性，在缓解患者病情、减少各种并发症方面具有重大意义。目前，在国内外报道Th17细胞表达川崎病发病机制中作用研究方面基本很少，而Th17细胞表达在丙种球蛋白耐药型川崎病发病机制中的作用方面的报道更是少数。本研究通过流式细胞术及荧光定量PCR对丙种球蛋白耐药型川崎病患者的Th17细胞进行检测，从细胞学、分子生物学等领域系统全面地探讨Th17细胞表达与丙种球蛋白耐药型川崎病发病的相关性，为丙种球蛋白耐药型川崎病的治疗及预后提供新的研究途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年5月～2014年5月在本院诊断为川崎病的患儿100例作为研究对象，根据是否存在耐药性分为丙种球蛋白耐药组和非丙种球蛋白耐药组，另选择30例正常儿童作为健康对照组。非丙种球蛋白耐药组共80例，年龄5个月～6岁，男性56例，女性24例；丙种球蛋白耐药组20例，年龄6个月～6岁，男性14例，女性6例；健康对照组30例，年龄7个月～6.4岁，男性16例，女性14例。3组的年龄、性别比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。受试者家属对实验已知情，并且签字同意。

1.2 研究方法

采研究对象静脉血4～5 ml，抗凝（EDTA），采取Ficoll密度梯度离心进行分离并提取患儿的外周血单个核细胞（PBMCs）。流式细胞术来检测各组患儿的Th17细胞水平：调整PBMC细胞浓度为2×106/ml，1 ml 1640培养基（含10%小牛血清）于24孔板内培养。其中加入PMA：50 ng/ml，Ionomycin：750 ng/ml，高尔基阻断剂1 μl在温度为37℃、5% CO2的培养箱内培养4～6 h，收集细胞到EP管内，1500 r/min离心5 min，去上清，暗室内用单抗抗人-CD3-PECy5，CD8-FITC室温孵育20 min，表面染色后固定、破膜，用抗人-IL-17A-PE胞内染色检测Th17细胞的比例。Th17的检测以相应的同型IgG染色细胞作为阴性对照。采用荧光定量PCR检测IL-23P19与RORrt基因mRNA表达，RORrt基因序列为F：5′-TCAGTCATGAGAACACAAATTGA-3′，R：5′GCACCCCTCACAGGTGATAA-3′；IL-23P19为F：5-′GGGAGATGAAGAGACTACAAATGATGT-3′，R：5′-CATATTGGAACATGTAAACCATGTAGTTG-3′。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以x±s表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组外周血PBMCs中Th17细胞占CD4+细胞百分率的比较

丙种球蛋白耐药组外周血PBMC中Th17细胞占CD4+百分率为（1.286±0.616）%，明显高于非丙种球蛋白耐药组的（0.913±0.469）%及健康对照组的（0.549±0.416）%，且非丙种球蛋白耐药组外周血PBMC中Th17细胞占CD4+百分率高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

与丙种球蛋白耐药组比较，*P<0.05；与健康对照组比较，#P<0.05

2.2 3组IL-23P19与RORrt基因mRNA相对表达量的比较

丙种球蛋白耐药组RORrt基因mRNA相对表达量高于非丙种球蛋白耐药组及健康对照组，且非丙种球蛋白耐药组高于健康对照组（P<0.05）；丙种球蛋白耐药组IL-23P19基因mRNA相对表达量高于非丙种球蛋白耐药组及健康对照组（P<0.05），但非丙种球蛋白耐药组与健康对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

3 讨论

1967年在日本，川崎教授首次完整地描述并报道了川崎病，目前因为对川崎病的认识加深且常可以及时地治愈链球菌感染等各种因素，川崎病的发病率已超越了儿童风湿热。相关资料表明，全球川崎病平均发病率是3.4/10万～100/10万，尤以日本最高，日本5岁以下的儿童其发病率达到惊人的100/10万，而在北美洲的美国仅仅是10/10万。男女发病比例是1.3∶1.7[3-5]。发病无明显季节差异。川崎病最主要的并发症为冠状动脉损伤。通过使用大剂量的丙种球蛋白（IVIG），冠状动脉病变的发生率可有效降低，然而在一些发达国家，并发症冠状动脉病变已成为一种最常见的小儿获得性心脏病。在出现川崎病急性期后，会持续地存在冠状动脉损害，这是导致患儿死亡的一个主要原因[6-7]，本研究结果显示，川崎病患者外周血Th17细胞占CD4+细胞百分率明显高于健康对照组（P<0.05），可认为Th17细胞在介导炎症反应中占主要作用；Th17细胞及IL-23P19与RORrt在丙种球蛋白耐药型川崎病患者中的表达量比非丙种球蛋白耐药型川崎病及健康对照组多，差异有统计学意义（P<0.05），可认为增高的Th17可诱发各种炎症因子释放，促进丙种球蛋白耐药型川崎病的血管损伤和炎症反应。

近年来已发现Th17细胞和Th1、Th2不同，能产生IL-17功能的又一群CD4+辅助性T细胞，能参与介导炎症反应、参与自身免疫性疾病、参与移植排斥反应及肿瘤免疫，其在多种自身免疫性疾病、急慢性炎症的调节轴中占有最中心地位[8-11]，如多发性硬化、炎性肠病、类风湿关节炎等。Th17分泌的物质主要有IL-17A、IL-22、IL-17F等，其中IL-17A具备强促炎作用，能与IL-17受体相结合，促进MCP-1、TNF-α、CCX、MIP-2等各种趋化因子、MMP的表达，能有效趋化单核细胞、中性粒细胞至炎症部位，能介导组织渗透及损伤，还能刺激前列腺素E2、IL-6的产生及损伤内皮细胞[6]。同时，其还可以与IL-1β、TNF-α等其他炎症因子协同作用而发挥增效作用，造成炎症反应的进一步加重。Th17细胞会通过分泌IL-17而作用不同的靶点细胞，诱导产生其他各种细胞因子，参与细胞因子的网络调节，触发释放炎症递质，进而有效地发挥生物效应，表明Th17细胞确实在川崎病发病中参与作用，而其在丙种球蛋白耐药型川崎病中的作用目前仍不甚清楚。

本研究进一步通过检测丙种球蛋白耐药型川崎病患儿Th17细胞、IL-23P19与RORrt的变化旨在进一步探讨Th17、IL-23P19与RORrt在检测丙种球蛋白耐药型川崎病的免疫发病机制中的意义，从细胞学、分子生物学等领域系统全面地探讨Th17、IL-23P19与RORrt细胞表达与丙种球蛋白耐药型川崎病发病的相关性，为丙种球蛋白耐药型川崎病的诊治及预后提供理论依据，从而减少川崎病患儿冠状动脉损害及心脏损害的后遗症，保护儿童身心健康。

[参考文献]

[1] Kuo HC，Chang WC，Yang KD，et al.Kawasaki disease and subsequent risk of allergic diseases：a population-based matched cohort study[J].BMC Pediatr，2013，13（1）：38.

[2] 张晓梅，孙景辉.川崎病诊治进展[J].实用儿科临床杂志，2011，26（1）：52-55.

[3] Park HM，Lee DW，Hyun MC，et al.Predictors of nonresponse to intravenous immunoglobulin therapy in Kawasaki disease[J].Korean J Pediatr，2013，56（2）：75-79.

[4] 陈婧，马彬，林丽星，等.不同剂量丙种球蛋白治疗川崎病的疗效的Meta分析[J].中国当代儿科杂志，2011，13（8）：638-643.

[5] 朴金花，金莲花，孙景辉，等.大剂量静脉注射丙种球蛋白无反应性川崎病的临床分析[J].临床儿科杂志，2009，27（5）：480-483.

[6] 张庆，李晓静.川崎病的治疗现状[J].心血管病学进展，2010，31（5）：766-769.

[7] 丁艳，尹薇，熊越华，等.川崎病患儿免疫功能的检测及临床价值[J].中华风湿病学杂志，2012，16（9）：588-592.

[8] 韩云坤，孙冰，李丽红，等.川崎病T细胞免疫及细胞因子变化的研究[J].中国实验诊断学，2011，15（9）：1533-1536.

[9] 王从军，陈梅，雷中劲，等.川崎病患儿细胞免疫功能状况及转录因子T-bet和GATA3的调控作用[J].中国病理生理杂志，2014，30（4）：733-737.

[10] 晏萍兰，李萍.静脉注射丙种球蛋白治疗小儿川崎病不良反应观察与护理[J].实用医学杂志，2012，28（8）：1366-1368.

[11] 王国兵，温鹏强，王勤，等.急性期川崎病患儿调节性B细胞改变及意义初探[J].中华微生物学和免疫学杂志，2013，33（10）：750-755.

（收稿日期：2014-06-30 本文编辑：李亚聪）

近年来已发现Th17细胞和Th1、Th2不同，能产生IL-17功能的又一群CD4+辅助性T细胞，能参与介导炎症反应、参与自身免疫性疾病、参与移植排斥反应及肿瘤免疫，其在多种自身免疫性疾病、急慢性炎症的调节轴中占有最中心地位[8-11]，如多发性硬化、炎性肠病、类风湿关节炎等。Th17分泌的物质主要有IL-17A、IL-22、IL-17F等，其中IL-17A具备强促炎作用，能与IL-17受体相结合，促进MCP-1、TNF-α、CCX、MIP-2等各种趋化因子、MMP的表达，能有效趋化单核细胞、中性粒细胞至炎症部位，能介导组织渗透及损伤，还能刺激前列腺素E2、IL-6的产生及损伤内皮细胞[6]。同时，其还可以与IL-1β、TNF-α等其他炎症因子协同作用而发挥增效作用，造成炎症反应的进一步加重。Th17细胞会通过分泌IL-17而作用不同的靶点细胞，诱导产生其他各种细胞因子，参与细胞因子的网络调节，触发释放炎症递质，进而有效地发挥生物效应，表明Th17细胞确实在川崎病发病中参与作用，而其在丙种球蛋白耐药型川崎病中的作用目前仍不甚清楚。

本研究进一步通过检测丙种球蛋白耐药型川崎病患儿Th17细胞、IL-23P19与RORrt的变化旨在进一步探讨Th17、IL-23P19与RORrt在检测丙种球蛋白耐药型川崎病的免疫发病机制中的意义，从细胞学、分子生物学等领域系统全面地探讨Th17、IL-23P19与RORrt细胞表达与丙种球蛋白耐药型川崎病发病的相关性，为丙种球蛋白耐药型川崎病的诊治及预后提供理论依据，从而减少川崎病患儿冠状动脉损害及心脏损害的后遗症，保护儿童身心健康。

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[10] 晏萍兰，李萍.静脉注射丙种球蛋白治疗小儿川崎病不良反应观察与护理[J].实用医学杂志，2012，28（8）：1366-1368.

[11] 王国兵，温鹏强，王勤，等.急性期川崎病患儿调节性B细胞改变及意义初探[J].中华微生物学和免疫学杂志，2013，33（10）：750-755.

（收稿日期：2014-06-30 本文编辑：李亚聪）

近年来已发现Th17细胞和Th1、Th2不同，能产生IL-17功能的又一群CD4+辅助性T细胞，能参与介导炎症反应、参与自身免疫性疾病、参与移植排斥反应及肿瘤免疫，其在多种自身免疫性疾病、急慢性炎症的调节轴中占有最中心地位[8-11]，如多发性硬化、炎性肠病、类风湿关节炎等。Th17分泌的物质主要有IL-17A、IL-22、IL-17F等，其中IL-17A具备强促炎作用，能与IL-17受体相结合，促进MCP-1、TNF-α、CCX、MIP-2等各种趋化因子、MMP的表达，能有效趋化单核细胞、中性粒细胞至炎症部位，能介导组织渗透及损伤，还能刺激前列腺素E2、IL-6的产生及损伤内皮细胞[6]。同时，其还可以与IL-1β、TNF-α等其他炎症因子协同作用而发挥增效作用，造成炎症反应的进一步加重。Th17细胞会通过分泌IL-17而作用不同的靶点细胞，诱导产生其他各种细胞因子，参与细胞因子的网络调节，触发释放炎症递质，进而有效地发挥生物效应，表明Th17细胞确实在川崎病发病中参与作用，而其在丙种球蛋白耐药型川崎病中的作用目前仍不甚清楚。

本研究进一步通过检测丙种球蛋白耐药型川崎病患儿Th17细胞、IL-23P19与RORrt的变化旨在进一步探讨Th17、IL-23P19与RORrt在检测丙种球蛋白耐药型川崎病的免疫发病机制中的意义，从细胞学、分子生物学等领域系统全面地探讨Th17、IL-23P19与RORrt细胞表达与丙种球蛋白耐药型川崎病发病的相关性，为丙种球蛋白耐药型川崎病的诊治及预后提供理论依据，从而减少川崎病患儿冠状动脉损害及心脏损害的后遗症，保护儿童身心健康。

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[5] 朴金花，金莲花，孙景辉，等.大剂量静脉注射丙种球蛋白无反应性川崎病的临床分析[J].临床儿科杂志，2009，27（5）：480-483.

[6] 张庆，李晓静.川崎病的治疗现状[J].心血管病学进展，2010，31（5）：766-769.

[7] 丁艳，尹薇，熊越华，等.川崎病患儿免疫功能的检测及临床价值[J].中华风湿病学杂志，2012，16（9）：588-592.

[8] 韩云坤，孙冰，李丽红，等.川崎病T细胞免疫及细胞因子变化的研究[J].中国实验诊断学，2011，15（9）：1533-1536.

[9] 王从军，陈梅，雷中劲，等.川崎病患儿细胞免疫功能状况及转录因子T-bet和GATA3的调控作用[J].中国病理生理杂志，2014，30（4）：733-737.

[10] 晏萍兰，李萍.静脉注射丙种球蛋白治疗小儿川崎病不良反应观察与护理[J].实用医学杂志，2012，28（8）：1366-1368.

[11] 王国兵，温鹏强，王勤，等.急性期川崎病患儿调节性B细胞改变及意义初探[J].中华微生物学和免疫学杂志，2013，33（10）：750-755.

（收稿日期：2014-06-30 本文编辑：李亚聪）