大果沙棘果渣黄酮体外抗氧化活性

摘要：采用超声波法提取及大孔树脂吸附法分离纯化大果沙棘黄酮，以芸香苷、儿茶素为对照，测定大果沙棘果渣黄酮对羟基自由基（·OH）、对超氧阴离子（ O-2· ）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力。结果表明，分离纯化前后的大果沙棘黄酮对超氧阴离子（ O-2· ）、羟基自由基（·OH）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力都较高，相同浓度下，清除效果略低于芸香苷、儿茶素标准对照品。纯化后总黄酮的体外抗氧化能力都强于粗提黄酮。

关键词：大果沙棘；果渣；黄酮；抗氧化活性；纯化

中图分类号： R284.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0285-02

收稿日期：2013-12-27

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术与研究项目（编号：12521593） 。

作者简介：焦岩（1981—），男，黑龙江肇东人，博士，讲师，研究方向为植物活性物质与功能食品。E-mail：jiaoyan_3000@126.com。沙棘（Hippophae rhamnoides L.）为胡颓子科（Elaeagnaceae）酸刺属植物，在俄罗斯、蒙古、中国等国分布较多[1-2]。沙棘含有丰富的黄酮类物质，果实中黄酮含量为0.309%～0.945%。研究表明，沙棘果实中的黄酮类能增强人体的耐受性、减少毛细血管的渗透性，对血液中的胆固醇、甘油三酯有明显的降低作用，对血垢、陈血细胞、血液中的垃圾有显著的净化作用[3-5]。目前，沙棘饮料加工过程中，常将沙棘果皮渣作为废料丢弃，不仅造成环境污染，也是一种资源浪费。本研究分析大果沙棘果渣中的总黄酮含量及其抗氧化活性，旨在为大果沙棘的综合加工利用提供依据。

1材料与方法

1.1材料

大果沙棘果渣由黑龙江省黑河市孙吴县林业局提供。芸香苷、儿茶素标准品、DPPH（1，1-dipheny1-2-picrylhydra-zyl）、ABTS[2，2′-amino-di（2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt]购自美国Sigma公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、邻苯三酚等试剂均为国产分析纯。756PC型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司），PHS-25型数显pH计（上海精密科学仪器有限公司），ALC-110.4电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），XW-80A漩涡混合器（天津市欧诺仪器仪表有限公司），TDL-5型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2方法

1.2.1大果沙棘果渣总黄酮提取纯化用超临界CO2萃取设备将大果沙棘果渣脱脂。用75%乙醇作为溶剂，将脱脂后的大果沙棘果渣粉以10 mL ∶1 g液固比超声波提取3次，将得到的黄酮液经过离心、过滤、浓缩、除去乙醇等步骤，得到大果沙棘果渣黄酮溶液[6]。将黄酮溶液用X-5大孔树脂层析柱进行纯化，纯化后真空冻干得到橙黄色固体粉末，采用 NaNO2-Al（NO3）3 比色法测定结果表明，分离前后大果沙棘果渣黄酮纯度分别为11.9%、34.1%[7-8]。用甲醇溶解，配制成浓度分别为10～200 mg/L的黄酮溶液进行体外抗氧化试验。

1.2.2大果沙棘总黄酮对羟自由基（·OH）的清除作用[9]在若干个10 mL比色管中依次加入10 mmoL/L水杨酸溶液0.5 mL，取0.5 mL不同浓度的纯化前后的大果沙棘总黄酮溶液以及芸香苷、儿茶素标准品溶液，加入0.5 mL 10 mmoL/L FeSO4 溶液、3.5 mL蒸馏水混合后加入5 mL 88 mmol/L H2O2溶液，启动 Fenton反应，混匀后于510 nm波长下测定吸光度D1。取0.5 mL蒸馏水代替10 mmoL/L FeSO4 溶液，510 nm波长下测定吸光度D2。取0.5 mL蒸馏水代替样品溶液，510 nm波长下测定吸光度D3。羟自由基（·OH）清除率计算公式如下：

羟自由基清除率=[1-（D1-D2）/D3]×100%。

1.2.3对超氧阴离子（ O-2· ）的清除试验[10]取pH值为 8.2的50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液4.5 mL，加入4.2 mL蒸馏水，混匀后在25 ℃水浴中保温20 min，取出后立即加入25 ℃下预热的0.3 mL邻苯三酚溶液（用10 mmol/L HCl配制），迅速摇匀后，于325 nm波长下每隔30 s测定1次吸光度，邻苯三酚自氧化5 min后，计算线性范围内每分钟吸光度的增加值ΔD0，用10 mmol/L HCl代替邻苯三酚作为空白。在加入邻苯三酚之前，加入不同体积的200 μg/mL纯化前后的大果沙棘总黄酮溶液以及芸香苷、儿茶素标准品溶液作为待测液，按照上述步骤测定每分钟吸光度的增加值ΔD。 O-2· 清除率计算公式如下：

O-2· 清除率=（ΔD0-ΔD）/ΔD×100%。

1.2.4大果沙棘总黄酮对DPPH·自由基清除效果[11]准确称取20 mg DPPH，用无水乙醇溶解并定容至250 mL，配制DPPH溶液。分别吸取10～100 mg/mL纯化前后的大果沙棘总黄酮溶液以及芸香苷、儿茶素标准品溶液 2.0 mL 置于具塞试管中（分2组），向其中一组加入DPPH溶液至2 mL，摇匀30 min后，用无水乙醇作参比在517 nm波长下测吸光度Di。测定2 mL DPPH溶液与2 mL无水乙醇混合后的吸光度Dc。向另一组中加入无水乙醇至2 mL，混合后测其吸光度Dj。DPPH·自由基清除率K计算公式如下：

K=[1-（Di-Dj）/Dc]×100%。

1.2.5大果沙棘总黄酮清除ABTS+自由基的活力测定[12]将5 mL 7 mmol/L ABTS溶液与88 μL 140 mmol/L过硫酸钾溶液混合，室温避光条件下静置过夜，形成ABTS+自由基储备液。该储备液在室温避光条件下稳定。使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm波长下的吸光度为0.7±0.02。取100 μL不同浓度的大果沙棘黄酮及对照品溶液，加入2 mL ABTS+溶液，振荡30 s，20 ℃下测定混合液在734 nm处6 min内的吸光度变化。ABTS+自由基抑制率计算公式如下：endprint

抑制率=D0-（Dt-B）/D0×100%。

式中：D0为未加样品的ABTS+的吸光度；Dt表示样品与ABTS反应的吸光度；B表示空白样品的吸光度；t=6 min。

2结果与分析

2.1大果沙棘总黄酮对羟自由基（·OH）的清除效果

由图1可以看出，当大果沙棘总黄酮浓度为20～100 μg/mL 时，·OH清除率较高。当大果沙棘总黄酮浓度为100 μg/mL时，纯化前后总黄酮对·OH的清除率分别为448%、54.9%，略低于儿茶素、芸香苷标准品。对·OH的清除能力由大到小依次为儿茶素>芸香苷>纯化黄酮>粗提黄酮。

2.2大果沙棘总黄酮对超氧阴离子（ O-2· ）的清除效果

由图2可以看出，当大果沙棘总黄酮浓度为40～200 μg/mL时，对 O-2·清除率较高。当大果沙棘总黄酮浓度为200 μg/mL时，纯化前后黄酮对 O-2· 的清除率分别为539%、62.7%，低于儿茶素、芸香苷标准品。对O-2·的清除能力由大到小依次为儿茶素>芸香苷>纯化黄酮>粗提黄酮。

2.3大果沙棘总黄酮对DPPH·自由基清除效果

由图3可以看出，当大果沙棘总黄酮浓度为20～100 μg/mL 时，对DPPH·自由基清除率较高。当大果沙棘总黄酮浓度为100 μg/mL时，纯化前后黄酮对DPPH·自由基的清除率分别为49.7%、65.1%。

2.4大果沙棘总黄酮对ABTS+自由基的清除效果

由图4可知，当大果沙棘总黄酮浓度为20～40 μg/mL时，对ABTS+自由基清除能力由大到小依次为儿茶素>芸香苷>纯化黄酮>粗提黄酮；但是当浓度大于60 μg/mL时，纯化黄酮对ABTS+自由基的清除能力略大于芸香苷，但始终小于儿茶素。

3结论

本研究探讨了大果沙棘果渣总黄酮的体外抗氧化能力，结果表明，分离纯化前后的大果沙棘黄酮对超氧阴离子（O-2· ）、羟基自由基（·OH）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力都较高，相同浓度下，清除效果略低于芸香苷、儿茶素标准对照品。纯化后总黄酮的体外抗氧化能力都强于粗提黄酮，说明大果沙棘黄酮的纯度及其抗氧化活性存在着显著的量效关系，通过和黄酮类标准品对比也进一步证实了大果沙棘总黄酮的体外抗氧化作用。

参考文献：

[1]刘雪凌，权永荣，陈旭华. 沙棘产品的开发及应用前景[J].安徽农业科学，2012，40（16）：8960-8961，8987.

[2]闫涛，罗丽梅，谢竹田，等. 沙棘的化学成分及生物功能的研究进展[J].吉林医药学院学报，2010，31（1）：52-54.

[3]李垚，张慧颖，王鹏祖. 沙棘营养成分及作用的研究进展[J].中国初级卫生保健，2007，21（3）：73-76.

[4]Ercisli S，Orhan E，Ozdemir O，et al. The genotypic effects on the chemical composition and antioxidant activity of sea buckthorn （Hippophae rhamnoides L.） berries grown in Turkey[J]. Scientia Horticulturae，2007，115（1）：27-33.

[5]张滨，粟登权，曾丹，等. 响应面法提取沙棘抗氧化成分工艺优化[J].食品工业，2013，34（5）：75-79.

[6]杜广芬，蔡志华，代斌，等. 超声波-微波协同提取沙棘总黄酮的研究[J].食品工业科技，2012，33（8）：330-332，343.

[7]杜瑞娟，张聪璐，梁宁，等. 大孔树脂纯化核桃楸皮总黄酮工艺[J].沈阳药科大学学报，2013，30（4）：298-302.

[8]何可群，李相兴.民族药金丝梅总黄酮含量的测定[J].江苏农业科学，2013，41（5）：307-309.

[9]陈玉霞，刘建华，林峰，等. DPPH和FRAP法测定41种中草药抗氧化活性[J].实验室研究与探索，2011，30（6）：11-14.

[10]赵丹丹，郑鸿雁. 多年生藤本豆与大豆中黄酮类化合物体外抗氧化活性比较研究[J].食品工业科技，2013，34（8）：154-157.

[11]邱金东，汤昆. DPPH和ABTS法测定核桃仁的体外抗氧化活性[J].中成药，2008，30（8）：1215-1216.

[12]孟庆焕，王化，王洪政，等. 牡丹种皮黄酮提取及对ABTS自由基清除作用[J].植物研究，2013，33（4）：504-507.杨怀君，阎洪山，卢勇涛，等. 乌斯特智能在线检测控制系统试验分析[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：287-288.endprint

抑制率=D0-（Dt-B）/D0×100%。

式中：D0为未加样品的ABTS+的吸光度；Dt表示样品与ABTS反应的吸光度；B表示空白样品的吸光度；t=6 min。

2结果与分析

2.1大果沙棘总黄酮对羟自由基（·OH）的清除效果

由图1可以看出，当大果沙棘总黄酮浓度为20～100 μg/mL 时，·OH清除率较高。当大果沙棘总黄酮浓度为100 μg/mL时，纯化前后总黄酮对·OH的清除率分别为448%、54.9%，略低于儿茶素、芸香苷标准品。对·OH的清除能力由大到小依次为儿茶素>芸香苷>纯化黄酮>粗提黄酮。

2.2大果沙棘总黄酮对超氧阴离子（ O-2· ）的清除效果

由图2可以看出，当大果沙棘总黄酮浓度为40～200 μg/mL时，对 O-2·清除率较高。当大果沙棘总黄酮浓度为200 μg/mL时，纯化前后黄酮对 O-2· 的清除率分别为539%、62.7%，低于儿茶素、芸香苷标准品。对O-2·的清除能力由大到小依次为儿茶素>芸香苷>纯化黄酮>粗提黄酮。

2.3大果沙棘总黄酮对DPPH·自由基清除效果

由图3可以看出，当大果沙棘总黄酮浓度为20～100 μg/mL 时，对DPPH·自由基清除率较高。当大果沙棘总黄酮浓度为100 μg/mL时，纯化前后黄酮对DPPH·自由基的清除率分别为49.7%、65.1%。

2.4大果沙棘总黄酮对ABTS+自由基的清除效果

由图4可知，当大果沙棘总黄酮浓度为20～40 μg/mL时，对ABTS+自由基清除能力由大到小依次为儿茶素>芸香苷>纯化黄酮>粗提黄酮；但是当浓度大于60 μg/mL时，纯化黄酮对ABTS+自由基的清除能力略大于芸香苷，但始终小于儿茶素。

3结论

本研究探讨了大果沙棘果渣总黄酮的体外抗氧化能力，结果表明，分离纯化前后的大果沙棘黄酮对超氧阴离子（O-2· ）、羟基自由基（·OH）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力都较高，相同浓度下，清除效果略低于芸香苷、儿茶素标准对照品。纯化后总黄酮的体外抗氧化能力都强于粗提黄酮，说明大果沙棘黄酮的纯度及其抗氧化活性存在着显著的量效关系，通过和黄酮类标准品对比也进一步证实了大果沙棘总黄酮的体外抗氧化作用。

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[8]何可群，李相兴.民族药金丝梅总黄酮含量的测定[J].江苏农业科学，2013，41（5）：307-309.

[9]陈玉霞，刘建华，林峰，等. DPPH和FRAP法测定41种中草药抗氧化活性[J].实验室研究与探索，2011，30（6）：11-14.

[10]赵丹丹，郑鸿雁. 多年生藤本豆与大豆中黄酮类化合物体外抗氧化活性比较研究[J].食品工业科技，2013，34（8）：154-157.

[11]邱金东，汤昆. DPPH和ABTS法测定核桃仁的体外抗氧化活性[J].中成药，2008，30（8）：1215-1216.

[12]孟庆焕，王化，王洪政，等. 牡丹种皮黄酮提取及对ABTS自由基清除作用[J].植物研究，2013，33（4）：504-507.杨怀君，阎洪山，卢勇涛，等. 乌斯特智能在线检测控制系统试验分析[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：287-288.endprint

抑制率=D0-（Dt-B）/D0×100%。

式中：D0为未加样品的ABTS+的吸光度；Dt表示样品与ABTS反应的吸光度；B表示空白样品的吸光度；t=6 min。

2结果与分析

2.1大果沙棘总黄酮对羟自由基（·OH）的清除效果

由图1可以看出，当大果沙棘总黄酮浓度为20～100 μg/mL 时，·OH清除率较高。当大果沙棘总黄酮浓度为100 μg/mL时，纯化前后总黄酮对·OH的清除率分别为448%、54.9%，略低于儿茶素、芸香苷标准品。对·OH的清除能力由大到小依次为儿茶素>芸香苷>纯化黄酮>粗提黄酮。

2.2大果沙棘总黄酮对超氧阴离子（ O-2· ）的清除效果

由图2可以看出，当大果沙棘总黄酮浓度为40～200 μg/mL时，对 O-2·清除率较高。当大果沙棘总黄酮浓度为200 μg/mL时，纯化前后黄酮对 O-2· 的清除率分别为539%、62.7%，低于儿茶素、芸香苷标准品。对O-2·的清除能力由大到小依次为儿茶素>芸香苷>纯化黄酮>粗提黄酮。

2.3大果沙棘总黄酮对DPPH·自由基清除效果

由图3可以看出，当大果沙棘总黄酮浓度为20～100 μg/mL 时，对DPPH·自由基清除率较高。当大果沙棘总黄酮浓度为100 μg/mL时，纯化前后黄酮对DPPH·自由基的清除率分别为49.7%、65.1%。

2.4大果沙棘总黄酮对ABTS+自由基的清除效果

由图4可知，当大果沙棘总黄酮浓度为20～40 μg/mL时，对ABTS+自由基清除能力由大到小依次为儿茶素>芸香苷>纯化黄酮>粗提黄酮；但是当浓度大于60 μg/mL时，纯化黄酮对ABTS+自由基的清除能力略大于芸香苷，但始终小于儿茶素。

3结论

本研究探讨了大果沙棘果渣总黄酮的体外抗氧化能力，结果表明，分离纯化前后的大果沙棘黄酮对超氧阴离子（O-2· ）、羟基自由基（·OH）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力都较高，相同浓度下，清除效果略低于芸香苷、儿茶素标准对照品。纯化后总黄酮的体外抗氧化能力都强于粗提黄酮，说明大果沙棘黄酮的纯度及其抗氧化活性存在着显著的量效关系，通过和黄酮类标准品对比也进一步证实了大果沙棘总黄酮的体外抗氧化作用。

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[5]张滨，粟登权，曾丹，等. 响应面法提取沙棘抗氧化成分工艺优化[J].食品工业，2013，34（5）：75-79.

[6]杜广芬，蔡志华，代斌，等. 超声波-微波协同提取沙棘总黄酮的研究[J].食品工业科技，2012，33（8）：330-332，343.

[7]杜瑞娟，张聪璐，梁宁，等. 大孔树脂纯化核桃楸皮总黄酮工艺[J].沈阳药科大学学报，2013，30（4）：298-302.

[8]何可群，李相兴.民族药金丝梅总黄酮含量的测定[J].江苏农业科学，2013，41（5）：307-309.

[9]陈玉霞，刘建华，林峰，等. DPPH和FRAP法测定41种中草药抗氧化活性[J].实验室研究与探索，2011，30（6）：11-14.

[10]赵丹丹，郑鸿雁. 多年生藤本豆与大豆中黄酮类化合物体外抗氧化活性比较研究[J].食品工业科技，2013，34（8）：154-157.

[11]邱金东，汤昆. DPPH和ABTS法测定核桃仁的体外抗氧化活性[J].中成药，2008，30（8）：1215-1216.

[12]孟庆焕，王化，王洪政，等. 牡丹种皮黄酮提取及对ABTS自由基清除作用[J].植物研究，2013，33（4）：504-507.杨怀君，阎洪山，卢勇涛，等. 乌斯特智能在线检测控制系统试验分析[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：287-288.endprint